张丽霞, 吴雪伶, 陈雪清, 徐玲丽, 赵鹏, 孟淑芳
目的: 建立可定量检测质粒DNA 超螺旋构象相对百分含量的毛细管凝胶电泳法（CGE）,并开展方法学验证研究及初步应用探讨。方法: 选用涂层毛细管,采用荧光检测器CGE 法分离质粒DNA,首先通过限制性内切酶和缺刻酶处理法确认质粒DNA 超螺旋（covalently closed circular,ccc）、线性（linear）及开环（open circular,oc）这3 种构象在电泳图谱中的位置,然后通过对荧光染料、样品上样浓度等条件进行优化,建立质粒DNA 构象的检测方法。对所建方法进行专属性、准确性、线性、精密度、检测下限和定量下限验证,并通过将质粒DNA 置于不同保存温度、反复冻融及紫外照射后再进行质粒DNA 构象的检测,初步分析该方法应用的可行性。结果: 采用总长度为40 cm、有效长度为30.2 cm 涂层毛细管,毛细管和样品上样温度分别为20 ℃和4 ℃,质粒浓度为4 ng·μL-1 以1 378.95 Pa,4 s 上样分离,CGE 法可准确地定量质粒DNA 3 种构象所占的比例,且分离度良好。通过对3 种常用的质粒保存液基质的检测结果显示,这些基质不会干扰检测结果,专属性较好。质粒DNA 3 种构象的线性范围均在0.25~8 ng·μL-1,构象峰面积与上样浓度具有良好的线性关系,相关系数分别是0.997 7、0.999 4、0.992 7。将线性化质粒及开环质粒分别以3%~50% 添加至原质粒中,可检出的线性及开环构象的峰面积与添加浓度呈现良好的线性关系,相关系数分别为0.999 9 和0.997 2,线性构象的回收率在104%~120%,准确性良好;开环构象的回收率稍差,为68%~94%。将质粒DNA 分别以高（4 μg·mL-1）、中（2 μg·mL-1）、低（0.5 μg·mL-1）3 个浓度验证实验的重复性,结果显示,试验内重复性良好,质粒DNA 超螺旋构象迁移时间的RSD 在0.22%~0.54%,相对百分含量的RSD 在0.38%~2.1%; 中间精密度也较好,迁移时间的RSD 在0.52%~1.1%;相对百分含量的精密度在质量浓度为2 ng·μL-1 和 4 ng·μL-1 时,RSD 值分别为3.6%、0.25%。灵敏度的验证结果显示,定量下限及检测下限分别为0.5 ng·μL-1 和0.25 ng·μL-1。用该方法分别检测质粒DNA 在不同保存条件、冻融及紫外照射后的构象变化,结果显示,质粒DNA 在-80 ℃、-20 ℃保存1 周,超螺旋构象无明显变化,但在室温保存1 周后,质粒DNA 开环构象含量从1.39% 增加到4.16%;将质粒DNA 反复冻融5 次,未观察到明显的构象变化,但冻融7 次后,质粒DNA 开环构象相对百分含量从1.3% 左右增加到1.93%;质粒DNA 质量浓度在1 mg·mL-1 时,紫外照射 15 min 到3 h,质粒DNA 的超螺旋构象相对百分含量从96.97% 下降到54.38%,同时线性及开环构象明显增加。结论: 本研究建立的毛细管凝胶电泳法可以很好地将质粒DNA 的超螺旋、线性及oc 3 种构象分离,各构象分离度良好,可准确定量不同构象相对百分含量,线性相关系数不低于0.99,灵敏度高,可重复性好,且可灵敏地反映出质粒DNA 构象的变化,可用于质粒DNA 构象纯度检测的质量控制。
