2022年, 第42卷, 第6期　
刊出日期：2022-06-30

  

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生物活性检测方法验证专栏
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  生物活性检测方法的方法学研究概述^*

  杜颖, 李娜, 韩璐, 段丽, 谭德讲

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 924-930. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.01

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  生物活性检测方法在生物制品研发和质量控制中发挥着关键作用,近年来对该类方法的方法学研究也取得了长足进展。本文首先回顾生物活性检测方法研究的历史进程;其次,对国内外的药典、法规及技术指南中的生物活性检测方法内容进行梳理;最后,对生物活性检测方法学相关的最新进展进行概述和分析,包括分析方法生命周期、分析目标概要等新概念的介绍。希望本文能为药品行业相关人员全面了解国内外药品生物活性检测方法及其相关指导原则提供参考。同时,也希望为药品研发人员建立科学、可靠的生物活性检测方法提供理论支持。
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  生物活性检测方法的定义及分类辨析^*

  李娜, 杜颖, 刘翠, 郑学学, 李向群, 谭德讲

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 931-936. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.02

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  目的: 探索生物活性检测方法的定义和系统分类规范,为深入认识并全面理解生物活性方法的本质提供思路。方法: 根据生物活性检测方法的属性特征搭建生物活性方法分类框架,并阐述其分类意义。结果: (1)生物活性检测方法的定义在不同领域中的关注点不同,而导致侧重点不同,但主题思想基本一致。(2)在生物活性检测方法中,效价及其衍生术语均有明确的内涵和外延,准确使用这些术语可使表达更加专业和清晰。(3)生物活性检测方法可以根据所检测的生物效应直接与否、测定所用生物受试体特征、生物活性反应的性质和机理,以及活性检测结果的数据类型等众多属性进行划分。结论: 对生物活性检测方法进行科学规范地定义和分类,不仅有利于统一该类方法在应用时的表达规范性,还可深入了解方法的特性,为进一步理解方法,以及科学应用方法和改进方法提供理论依据和技术支撑。
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  生物活性检测方法研究中常用关键术语解析^*

  张媛, 郭龙静, 谭德讲

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 937-941. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.03

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  生物活性检测方法的全生命周期研究是药理学的重要内容,广泛应于药品的活性测定、新药研究以及激素、神经介质等的生理活性测定等领域,对某些药品尤其是生化类药品、生物制品等的检测仍起着无法替代的作用。生物活性检测方法由于使用生物受试体(变异大)、影响因素多,且涉及较多的数理统计内容,因而此类方法涉及的专业术语也较多,在理解和使用当中容易产生混淆。而对术语的正确理解是从事生物活性检测方法相关研究工作的根本基础,因此,本文针对生物活性检测方法中部分常用的关键术语,如方法适用性、重复、平行性等进行初步汇总和深入解析,以期对相关从业人员开展生物活性检测方法评估和应用工作有所助益。
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  生物活性检测方法量效关系模型的确立问题探讨^*

  谭德讲, 韩璐, 段丽, 李娜, 杜颖

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 942-950. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.04

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  目的: 探讨生物活性检测方法的量效关系模型确立方式和评估标准。方法: 结合对量效关系模型的最新研究进展,采用回顾性研究方式,对生物活性检测方法中的量效关系模型,从其重要性、常见生物反应的量效关系模型、模型确立前需要解决的问题,到模型确立需要的基本步骤进行梳理和分析。结果和结论: (1)量效关系建模是目前进行方法验证前的重要评价内容,是方法风险评估的出发点。(2)生物反应的量效关系模型较多,不仅包括直线模型,还包括多项式模型、logistic模型、Brain cousins模型、单位点和双位点结合的特异性和非特异性模型,以及质反应数据的probit模型等。(3)在模型确立前,需要结合专业和统计知识进行跨学科交流,找出反应窗,通过预实验确定合理的浓度数和各浓度下重复数,进行合理的实验设计,并事先确定模型的评估方法和接受标准。(4)模型确立的基本步骤包括评估各响应值的独立性、残差的正态性和同质性,以及最后对同类模型的择优选择方式等。
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  生物效价报告值表示的科学规范性探讨^*

  韩璐, 段丽, 谭德讲, 李娜, 杜颖, 杭太俊

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 951-955. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.05

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  目的: 探讨生物效价结果表示的科学规范性。方法: 从方法的适用性、报告值的规范性、有效数字修约等方面来进行论述。结果: (1)只有当生物活性检测方法同时满足了系统适用性检验与样品适用性检验,才能得到准确可靠的最终报告值。(2)报告值的表示应体现相应的精密度,一般采用所测效价值的相对置信区间来表示。(3)报告值表示需依据方法的变异度确定有效数字的位数,并遵循相关修约规则。结论: 生物效价报告值表示的科学规范性探讨,对于效价测定具有示范作用。
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  生物效价限度标准的确立要点探讨^*

  谭德讲, 韩璐, 段丽, 李娜, 杜颖, 梁争论

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 956-961. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.06

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  本文以效价限度标准制定为例,阐述了在产品质量标准中主成分限度标准的科学制定应考虑的基本因素及制定原理,包括(1)依据产品的安全性、有效性、工艺波动和稳定性波动范围等综合确定生物效价标示值的正常波动范围。(2)依据检测方法的检测能力(方法变异大小)确定效价标示值的相对置信范围。(3)给出以标示值精密度为依据确定的效价标示值有效数字位数。
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  生物活性检测方法的验证实验设计探讨^*

  谭德讲, 段丽, 耿颖, 韩璐, 李娜, 杜颖

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 962-965. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.07

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  科学的实验设计是保证检测方法的结果准确性和结论可靠性的主要工具。本文对影响因素多且变异大的生物活性检测方法验证所需的实验设计进行了探讨,并详细阐述了在方法验证设计中样本量的计算方法。希望今后能为生物活性检测方法验证人员准确理解方法验证实验设计提供理论参考。
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  方法满足预期用途的评估指标和标准探讨^*

  段丽, 韩璐, 杜颖, 李娜, 许卉, 谭德讲

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 966-971. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.08

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  目的: 系统阐述关于方法能力的评估指标及其标准,为科学、多角度地评估方法能力提供参考。方法: 结合生物活性检测方法验证特点,从各指标的定义、计算公式、用途及意义入手,论述5种新评估方法满足预期用途的能力指标及其判定标准。结果: 用来判断方法满足预期用途的新方法能力指标有:(1)方法的总分析误差(TAE);(2)报告值的预测区间(RVPI)和容忍区间(RVTI);(3)方法能力指数(MCI)和方法误判率(MMJP)。5个指标从不同角度提供了方法能力的量化评估,为药品开发者和监管者衡量方法能力提供更直观的评估指标。结论: 利用严谨的方法验证获得的实验数据集和统计技术,可以获得更多直接并易于理解的方法能力评估指标;这些指标不仅丰富方法的属性集,而且可对方法有更深入的理解。
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  方法验证数据集的应用探讨^*

  段丽, 韩璐, 杜颖, 耿颖, 李娜, 许卉, 谭德讲

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 972-978. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.09

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  目的: 充分挖掘方法验证的数据集,为方法后期的广泛应用提供更多参考依据。方法: 利用严谨设计的方法验证所得数据集,通过对数据集中各方差分量的拆分或组合,构建日常实践中方法应用所需的评价依据或标准。结果: 通过验证实验数据集的不同方差分量的拆分和组合,可形成3个应用评价指标或标准:(1)方法操作模式的变异度(FV);(2)报告值的区分阈值(RVDT);(3)实验室能力评定标准差(σ_PT)。除此之外,还可利用验证数据集中影响因素的限制性最大似然(REML)方差分量值来辨识影响方法的主要因素,为实验操作的改进提供预判方向。结论: 在方法验证过程中,使用科学严谨的验证实验设计所得的数据集,不仅可保证方法自身性能和方法检测能力的可靠评价,还可推导出更多有重要实践意义的应用评价标准,并对方法特性有更全面的了解。本文所论述指标,不仅适合于生物活性检测方法,也适合于理化方法。
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  生物活性检测方法验证统计分析软件的设计和功能^*

  韩璐, 隋思涟, 谭德讲, 段丽, 李娜, 杜颖, 施瑞红

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 979-987. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.10

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  生物活性检测方法验证(biological method validation,BMV)统计分析软件是一款具有全部自主产权的专用统计分析软件。其优势在于:(1)提供常见的方法验证性能参数,如精密度及其置信上限、准确度及其相应的置信区间、范围等;(2)提供满足方法需求的判定标准,如分析总误差、报告值的预测区间、容忍区间、方法能力指数(MCI)等;(3)新增方法应用指标,包括操作模式变异度、报告值的区分阈值、能力验证标准差、方法关键影响因素分析等;(4)为使用者提供自主选择生物实验系统适用性模型,并可计算验证实验所需样本量。此软件不仅操作简便,而且输出结果科学可靠,可满足各国药典或指南对方法验证的要求。该软件的开发,将方便于药品行业研发人员建立科学可靠的生物活性检测方法,以确保药品的质量安全。
综述专论
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  代谢组学在乳腺癌生物标志物中的应用进展^*

  魏艳平, 李艳灵, 夏梦瑶, 陈威, 隗鑫曈, 王杰, 吕燕慧, 祖先鹏, 冯玉

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 988-999. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.11

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  乳腺癌是发生在乳腺上皮细胞处的恶性肿瘤,随着发病率的升高,乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤。乳腺癌患者的代谢发生显著改变,所以对乳腺癌代谢进行研究是寻找乳腺癌治疗靶点的途径之一。代谢组学作为新兴发展的学科,能够利用质谱和核磁共振技术对乳腺癌的代谢谱进行全方面的分析,提供肿瘤发生发展的关键信息。本文综述了近年来代谢组学在乳腺癌中的研究进展,以期为乳腺癌的临床治疗和研究提供新的思路。
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  稳定同位素分析技术在滥用药物来源解析中的应用^*

  吴世豪, 王继芬, 白海涛, 张震

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1000-1010. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.12

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  作为一种自然标记物,稳定同位素是物质来源解析的重要工具之一。与传统研究方法相比,稳定同位素技术方法安全、准确并且相对简单。其应用领域不断拓展,在滥用药物的来源解析中已发挥出了独特优势。本文简要介绍了稳定同位素技术的理论基础,着重阐述了该项技术在植源性毒品、传统合成毒品和新精神活性物质等的来源解析中的应用,并对稳定同位素在滥用药物来源解析中的应用前景做了简要展望。
成分分析·活性分析·代谢分析
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  成分分析·活性分析·代谢分析磁性碳纳米管萃取-高效液相色谱联用法测定唾液中的诺氟沙星

  傅璐璐, 陈锦涛, 陈秋, 郭胜男, 蒋娅鸯, 任立琴, 单伟光

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1011-1018. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.13

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  目的: 开发1种基于磁性碳纳米管的固相萃取-高效液相色谱联用技术,用于快速、简便、高效地测定唾液中的诺氟沙星。方法: 合成1种以传统的碳纳米管材料为基础的新型磁性碳纳米管材料,作为固相萃取吸附剂,采用傅立叶红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、场发射透射电镜(TEM)对其物性进行表征;经萃取条件优化后,利用其吸附性能分离富集唾液中的诺氟沙星,联合HPLC,采用 C₁₈色谱柱,以 0.025 mol·L^-1磷酸水溶液-乙腈(87∶13)为流动相,在278 nm检测波长下,测定诺氟沙星浓度。结果: 本研究制备的磁性碳纳米管磁性反应灵敏,吸附率大于90%,重复使用12次性能良好,与HPLC联用测定人工唾液中诺氟沙星含量,质量浓度在0.4~20 μg·mL^-1范围内线性关系良好(r²=0.999 8),该方法下的检测限为0.01 ng·mL^-1,定量限为0.025 ng·mL^-1,日内和日间精密RSD均小于5%,萃取回收率RSD小于2%,测得诺氟沙星唾液样品浓度为1.902 μg·mL^-1。结论: 以磁性碳纳米管为吸附剂的磁性固相萃取技术结合高效液相色谱的方法可用于唾液中诺氟沙星的分离富集及检测,该方法萃取过程简便、快速,含量测定精密度高,准确度良好。
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  当归不同极性部位提取物5个成分含量测定及补血药效学研究^*

  李惠莹, 唐云丽, 钟文, 谭雨坪

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1019-1028. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.14

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  目的: 建立当归不同极性部位提取物中5个成分的含量测定方法;探讨中药当归不同极性部位提取物对血瘀证小鼠的干预作用。方法: 采用高效液相色谱(HPLC)法测定当归不同极性部位提取物中5个成分的含量;KM小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、当归石油醚组、正丁醇组、水部位组、乙酸乙酯组。实验第1天开始小鼠灌胃给药,空白组与模型组给予等量纯水。结果: 方法学考察各项指标符合规定,绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯、欧当归内酯A的平均加样回收率分别为99.3%、101.0%、98.5%、97.2%、99.1%,RSD均小于3.0%;当归各实验组中血栓素(TXB₂)含量下降,6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)含量明显升高(P＜0.05);模型组与空白组相比,血清组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)含量下降,血清纤溶酶原激活剂抑制物(PAI-1)和环磷酸腺苷(cAMP)含量上升(P＜0.05);当归各组与模型组相比,血清t-PA含量升高,血清PAI-1和cAMP含量降低(P＜0.05);与模型组比较,当归提取物各给药组和阳性对照组,外周血中红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞比容(HCT)均明显增加(P＞0.05);与模型组比较,当归各给药组及阳性对照组动物血清中白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)和促红细胞生成素(EPO)含量明显增加(P＜0.05);与模型组比较,当归各给药组动物血清中粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)含量均明显增加(P＜0.05);与空白组和阳性对照组比较,模型组动物脾脏指数明显增加(P＜0.05);与空白组和阳性对照组比较,模型组动物胸腺指数明显减小(P＜0.05)。结论: 本研究建立的含量测定方法专属性强,重复性好,准确度高,可用于绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯、欧当归内酯A的含量测定;当归可明显增加小鼠外周血RBC、PLT的数量,提高HGB含量,增加HCT比值;当归能够不同程度地提高与造血功能有关的细胞因子IL-3、EPO、G-CSF、M-CSF、VCMA-1的表达水平,对机体具有补血的作用;当归可以增加小鼠血清中6-keto-PGF1α的含量和降低血清中TXB₂含量,还可以提高血清中t-PA含量、降低PAI-1含量;当归可以维持小鼠血液中TXB₂/6-keto-PGF1α的动态平衡,调节血清中t-PA/PAI-1的平衡,纠正小鼠体内平衡失调的作用,当归具有补血作用。
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  HPLC-MS/MS测定人血浆中尼美舒利浓度及在室间质量评价中的应用^*

  刘嫄, 杨妍妍, 李扬, 赵士景, 杨明, 史爱欣

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1029-1036. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.15

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  目的: 建立检测人血浆中尼美舒利浓度的方法,组织室间质量评价,评价药代动力学实验室的检测能力,探讨该领域室间质量评价的流程及结果评价的方法。方法: 采用HPLC-MS/MS法,使用Xbridge C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm,3.5 μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液,梯度洗脱,流速0.45 mL·min^-1,柱温40 ℃,在电喷雾离子源(ESI),负离子模式下,多反应监测扫描(MRM),尼美舒利和内标氢氯噻嗪监测离子对分别为m/z 307.1→229.0和 m/z 296.0→204.7。制备质量评价样品,根据中国合格评定国家认可委员评价指南及相关指导原则进行质量评价样品均匀性和稳定性评价,并对参加实验室回报结果进行统计分析。结果: 建立的人血浆尼美舒利测定方法满足药物浓度测定要求,均匀性和稳定性评价结果满足质量评价样品发放和检测要求,本研究共有18家实验室参加,结果回报率为100%,满意率为83.3%。结论: 本次室间质量评价工作对18家实验室回报结果进行评价及系统的影响因素分析,为生物样本检测实验室发现自身检测存在问题,实验室能力的监控和改进提供依据,并可为今后拓展室间质量评价工作范围,持续组织与实施、建立实验室能力验证的长效机制提供帮助。
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  ELISA法测定大鼠血浆中抗体偶联药物浓度及药代动力学研究

  彭嘉宝, 彭缨

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1037-1044. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.16

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  目的: 建立检测大鼠血浆中抗体偶联药物(ADC006M)[重组抗人表皮生长因子受体2(HER2)结构域Ⅱ人源化单克隆抗体-单甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶联剂]浓度的酶联免疫吸附分析法(ELISA),并用于研究单次静脉注射的药代动力学特征。方法: 基于ELISA的检测原理,在96孔板上预先包被抗MMAE抗体,加入待测样品,用HRP标记的抗体B1G7(B1G7-HRP)进行检测,加入TMB底物显色,终止反应后,在酶标仪450 nm/630 nm波长处读取吸收度(A),并参考相关法规进行方法学验证。同时,单次静脉注射给予SD大鼠5 mg·kg^-1ADC006M测定其血浆浓度,对测定结果进行曲线拟合并计算药代动力学参数。结果: 确定方法的线性范围为31.25~2 000 ng·mL^-1,定量限为31.25 ng·mL^-1;方法批内、批间准确度RE分别在-14.6%~12.6%和-13.1%~-0.7%,批内、批间精密度RSD均≤12.6%;方法的选择性(基质效应)、特异性、稀释线性与钩状效应以及各项稳定性考察结果均良好。通过对SD大鼠血浆样品进行浓度测定,获得ADC006M药代动力学参数,雌鼠、雄鼠的C_max分别为(114 218±17 845)μg·L^-1和(119 900±12 259)μg·L^-1,AUC_0-∞分别为(90 546±6 481)μg·L^-1·d^-1和(89 648±13 735)μg·L^-1·d^-1,t_1/2分别为(1.46±0.33)d和(1.70±0.28)d。结论: 本文建立的检测大鼠血浆中ADC006M浓度的ELISA方法,特异性、准确度、精密度、稳定性等均符合生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求,ADC006M在大鼠体内的药代动力学特征不存在性别差异,其与同类ADC药物的代谢特征基本一致,具有较好的药代动力学特性。
安全监测
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  疫苗中硫柳汞含量测定及其降解产物分析^*

  焦旭雯, 陈龙少, 梁蔚阳

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1045-1053. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.17

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  目的: 建立HPLC法测定疫苗中硫柳汞的含量,与2020年版《中华人民共和国药典》收载的测定法进行比较。方法: 采用C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇- 0.05%三氟醋酸溶液(60∶40)为流动相;检测波长为222 nm,柱温为30 ℃。结果: 本法测定样品中硫柳汞的含量,与2020年版《中华人民共和国药典》测定无机汞离子含量结果存在一定差异。结论: 硫柳汞在疫苗生产过程中易降解,本法专属性好,可以更准确地测定疫苗中硫柳汞的含量。
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  防风饮片中掺有易混品水防风检测方法的研究^*

  杜娟, 李玮, 崔宇宏, 张禄, 连云岚, 薛非非, 张峰, 李民生

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1054-1064. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.18

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  目的: 建立防风饮片中掺混水防风的检测方法,并将其作为补充检验方法对市场中防风饮片掺伪情况进行研判。方法: 首先采用薄层色谱法(TLC),对水防风区别于防风的特征性成分[3’(S),4’(R)-双当归酰氧基-3’,4’-二氢花椒内酯]进行初筛,如果供试品溶液色谱中出现水防风特征斑点,则采用高效液相液相色谱法(HPLC)对其进行定量,色谱条件:Agilent Extent C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),乙腈-水(60∶40)为流动相,等度洗脱,流速为1.0 mL·min^-1,检测波长为324 nm。如果量值超出拟定限度,则判定防风饮片中掺有水防风。如有必要采用高效液相-质谱联用法(HPLC-MS)进行确证。结果: TLC、HPLC方法专属性、重复性、耐用性均较好,对2019年国家药品抽检的236批次防风饮片进行了检测,其中17批次检出水防风的特征成分[3’(S),4’(R)-双当归酰氧基-3’,4’-二氢花椒内酯],且超过拟定限量,占比为7.2%,存在掺伪情况。结论: 建立的方法可快速进行防风中掺混水防风的定性定量检测,有效地控制防风及其饮片的质量。
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  二维柱切换高效液相色谱法测定美白类化妆品中氢醌和苯酚^*

  王珵, 王嘉庆, 张立雯

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1065-1071. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.19

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  目的: 建立二维柱切换高效液相色谱法测定化妆品中氢醌、苯酚的分析方法。方法: 二维色谱柱均为C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),捕获柱为2条串联的C₁₆色谱柱(20 mm×4.0 mm,5 μm),10 mmol·L^-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH3.5)-甲醇为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,柱温35 ℃,检测波长280 nm,进样量2 μL。结果: 氢醌和苯酚线性范围分别为5.570～111.5 μg·mL^-1 (r=0.999 7)和5.410～108.1 μg·mL^-1(r =0.999 6),方法提取回收率分别为91.9%~92.6%和94.4%~94.7%,精密度试验的RSD分别为3.9%~4.1%和0.9%~2.1%,检测下限分别为0.70 μg·g^-1和0.69 μg·g^-1。市场随机抽取40批美白类化妆品样品(包含乳剂、霜剂、水剂等)均单次进样即可快速完成样品分析,无基质干扰。结论: 本法测定美白类化妆品中氢醌、苯酚含量的专属性好,方法快速、准确,可用于复杂基质的美白类化妆品中氢醌、苯酚的测定。
标准研讨
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  一测多评法测定川射干中8个异黄酮类成分的含量^*

  周洪旭, 张毅, 杨新勇, 曾军, 马双成, 孟大利

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1072-1080. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.20

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  目的: 建立同时测定川射干中8个异黄酮成分(射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素)的一测多评含量测定方法(QAMS法)。方法: 采用高效液相色谱法,使用Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈为流动相A,以水(含0.55%甲基-β-环糊精和0.1%磷酸)为流动相B,以0.1%磷酸为流动相C,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^-1,检测波长为266 nm,柱温为35 ℃。以鸢尾黄素为内参照物,采用多点校正法,分别建立射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素7个待测组分与鸢尾黄素的相对校正因子。采用校正因子计算8批川射干样品中7个待测物的含量,与外标法进行比较,验证QAMS法的准确性和可行性。结果: 8个待测组分的线性范围分别是25.00~800.00、2.50~80.00、3.06~100.00、1.53~50.00、6.12~200.00、1.53~50.00、1.53~50.00、1.53~50.00 μg·mL^-1。以鸢尾黄素为内参照物,上述7个组分的相对校正因子分别是1.643、1.445、2.036、1.334、1.241、1.548、1.268,在不同的实验条件下重复性比较好。同时8个批次川射干中8个组分的含量范围分别为射干苷(48.53~109.94 mg·g^-1)、鸢尾甲苷A(4.28~8.36 mg·g^-1)、鸢尾甲苷B(9.47~14.78 mg·g^-1)、野鸢尾苷(1.24~1.92 mg·g^-1)、鸢尾黄素(11.74~34.29 mg·g^-1)、鸢尾甲黄素B(3.00~7.07 mg·g^-1)、鸢尾甲黄素A(1.94~5.36 mg·g^-1)、野鸢尾黄素(1.02~2.28 mg·g^-1)。结论: 以鸢尾黄素为内参物,建立了7个异黄酮类成分的一测多评定量方法,该方法简便、准确、可靠、可节省大量对照品使用,可用于川射干的质量评价及定量分析。
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  HPLC双波长切换法同时测定加味益母草膏中5个成分的含量

  马春娟, 赵云鹤, 王月洁, 鲍慧玮, 李业波, 徐阳

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1081-1086. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.21

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  目的: 建立HPLC双波长切换法同时测定加味益母草膏中益母草碱、芍药苷、芦丁、阿魏酸和毛蕊花糖苷5个成分含量。方法: 采用Phenomenex Luna C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱(0~8 min,12%A→23%A;8~25 min,23%A→38%A;25~50 min,38%A→50%A),流速为1.0 mL·min^-1;检测波长为230 nm(益母草碱、芍药苷、芦丁)和322 nm(阿魏酸、毛蕊花糖苷),进样量为20 μL,柱温为30 ℃。结果: 益母草碱、芍药苷、芦丁、阿魏酸和毛蕊花糖苷的平均含量分别为1.586、0.348、0.186、0.036、0.034 mg·g^-1,5个成分线性关系良好(r＞0.999 5),平均加样回收率为98.8%~101.3%,RSD为1.1%~2.0%。结论: 此方法高效、简便,易操作,可同时测定加味益母草膏中5个成分的含量,检测结果准确度高,精密度好,可用于加味益母草膏的质量控制,也可为加味益母草膏的进一步研究及临床应用提供科学依据。
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  双标多测法在党参5个成分含量测定中的应用^*

  任月, 陈晓虎, 李青, 孙磊, 张毅, 马双成

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1087-1095. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.22

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  目的: 建立双标多测法同时测定党参中腺苷、色氨酸、紫丁香苷、绿原酸、党参炔苷的含量,探索双标多测法(双标线性校正法用于色谱峰定性以及采用相对校正因子定量)在党参质量评价中应用的准确性和可行性。方法: 采用HPLC法,以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0~10 min,3%A→5%A;10~20 min,5%A→15%A;20~30 min,15%→25%;30~50 min,60%A),流速为1 mL·min^-1,检测波长为257,214,218 nm,柱温25 ℃;在19根不同的C₁₈色谱柱上测定党参中5个成分的实际保留时间,计算各成分在各色谱柱保留时间的平均值,得到各成分的标准保留时间,选取腺苷(峰1)和紫丁香苷(峰3)作为双标化合物,使用双标线性校正法准确定位各成分色谱峰,预测成分在未知色谱柱的保留时间并与相对保留时间法进行比较。以中间峰紫丁香苷为参照物,计算其余成分的相对校正因子,对各成分进行定量,将所得结果与外标法进行比较。结果: 双标线性校正法能够准确预测待测化合物在未知色谱柱的保留时间,比相对保留时间法偏差更小,适用性更强;腺苷、色氨酸、绿原酸、党参炔苷相对于紫丁香苷的相对校正因子分别0.315 2、2.265 4、0.595 5、1.4414,RSD 均小于2%;相对校正因子法和常规外标法的定量结果显示二者无显著性差异。结论: 双标多测法同时测定党参5个成分,简便准确且经济实用,可更好地控制该品种质量。
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  基于2020年版《中华人民共和国药典》相关蛋白检测方法并联合质谱分析人干扰素α2b相关蛋白的一级结构

  朱秋媚, 刘玉林, 俞露, 王江林, 梁冠桥, 孙瑞欣, 刘琳琳, 刘景会

  药物分析杂志. 2022, 42(6): 1096-1100. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.06.23

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  目的: 用人干扰素α2b相关蛋白检测方法联合质谱对人干扰素α2b相关蛋白进行一级结构分析,确认不同保留时间的相关蛋白。方法: 液相色谱条件为Agilent ZORBAX C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,300,5 μm);流动相A为30%乙腈水溶液(含0.2%三氟乙酸),流动相B为80%乙腈水溶液(含0.2%三氟乙酸),流速为0.5 mL·min^-1,柱温为室温。质谱条件为电喷雾正离子模式,采用MS模式进行扫描,毛细管电压为2 500 V,Cone电压为40 V,去溶剂气体温度为350 ℃,源温为120 ℃,去溶剂气体流速为800 L·h^-1,扫描范围为m/z 400~4 000,碰撞电压为40 V,MS采集时间为20~60 min。结果: 相关蛋白的相对分子质量均与理论相对分子质量一致,3号峰为主峰,相对分子质量为19 264.81和19 395.93,为人干扰素α2b和N-末端甲硫氨酸化人干扰素α2b;1号峰相对分子质量为19 280.72,为氧化人干扰素α2b,2号峰相对分子质量为19 412.25,为(氧化+N-末端甲硫氨酸化)人干扰素α2b;4号峰相对分子质量为19 265.13,为人干扰素α2b;5号峰相对分子质量为19 322.81,为(氧化+N-末端乙酰化)人干扰素α2b;6号峰相对分子质量为19 306.79,为N-末端乙酰化人干扰素α2b。结论: 确认主峰为人干扰素α2b和N-末端甲硫氨酸化的人干扰素α2b,确认保留时间在主峰前面的相关蛋白分别为氧化和(氧化+N-末端甲硫氨酸化)修饰的人干扰素α2b,保留时间在主峰后面的相关蛋白分别为(氧化+N-末端乙酰化)和N-末端乙酰化修饰的人干扰素α2b。