2023年, 第43卷, 第12期　
刊出日期：2023-12-31

  

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基因治疗制品质量评价技术与方法专栏（二）
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  多重数字PCR在rAAV基因组完整性评价中的探索应用^*

  于雷, 王光裕, 凡文超, 史新昌, 周勇

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 1997-2003. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.01

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  目的:探索采用多重数字PCR(dPCR)技术评价重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)基因组完整性的可行性。方法:采用芯片式dPCR系统,针对rAAV基因组的末端反向重复序列(ITR)区和目的基因(或3’非翻译区)建立双重PCR法,通过适量稀释使模板DNA在PCR芯片中呈理论单拷贝分布(阳性孔低于20%),单阳性孔代表非完整片段,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价rAAV基因组的完整性;尝试采用不同样品前处理方式(病毒基因组DNA、病毒颗粒、DNaseⅠ处理),并比较测试结果。结果:双重PCR测得拷贝数与单重PCR基本一致,无明显干扰;在一定范围内,样本的实测拷贝数与模板量呈线性相关,但单阳、双阳比例基本一致;提取的病毒基因组DNA实测拷贝数减少,但双阳率高于未处理病毒样本,DNase Ⅰ处理后的病毒样本实测拷贝数明显减少,单阳、双阳比例与未处理病毒样本基本一致。结论:多重dPCR技术可用于评价rAAV产品基因组完整性,具有良好的应用前景。
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  数字PCR技术检测rAAV产品中质粒DNA残留^*

  凡文超, 于雷, 安怡方, 王光裕, 史新昌, 周勇

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2004-2009. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.02

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  目的:利用数字PCR(dPCR)技术检测重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)产品中质粒DNA残留。方法:针对质粒抗性基因KanR序列的4个不同区段设计引物探针,建立单重和双重dPCR检测KanR残留量;在双重dPCR中,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价KanR序列的分布情况;利用DNase Ⅰ消化游离的质粒DNA,评价病毒衣壳内错包装的质粒DNA情况。结果:4组单重dPCR实测KanR残留量之间基本一致(1.054×10⁸~1.467×10⁸ copies·μL^-1);双重dPCR与单重dPCR实测结果间无明显差异;双重dPCR在6~6 000 copies·μL^-1浓度范围内显示出良好的线性关系(r＞0.999)和重复性(RSD<20%);1/2,2/3和3/43种组合的双重PCR的双阳性孔占比基本一致,表明KanR基因的断裂可能更趋向于随机断裂;DNase Ⅰ处理前后结果提示,错包装的大片段质粒DNA(1/4双阳性)比游离的占比更高。结论:dPCR技术可用于检测rAAV产品中质粒DNA残留量,多重dPCR还可评估质粒DNA片段大小及分布情况。
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  qPCR法用于rAAV2-ND4注射液中可复制型AAV2(rcAAV2)的检测^*

  秦玺, 陈龙, 杨靖清, 李响, 周峰, 史新昌, 毕华, 王光裕, 朱留强, 安怡芳, 裴德宁, 周勇

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2010-2016. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.03

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  目的:建立并验证rAAV2-ND4中可复制型AAV2(rcAAV2)的qPCR检测方法。方法:rAAV2-ND4样品(3.0×10¹⁰ vg·mL^-1,每孔接种100 μL)和wtAd5辅毒(6.0 ×10⁹ TCID50·mL^-1,每孔接种10 μL)同时感染HEK293细胞(6.0×10⁵ cells·mL^-1,每孔1 mL接种至12孔板中,37 ℃和5%二氧化碳条件培养24 h),经过2 h感染后,更换为细胞培养基(含10%FBS的 DMEM,每孔加入1 mL),继续在37 ℃和5%二氧化碳条件培养48 h。收集细胞并用细胞裂解液处理,细胞裂解物再经上述步骤进行1次感染和培养。收集第二次培养的细胞并加入裂解液56 ℃孵育30 min,之后90 ℃孵育10 min。处理后的细胞裂解物用qPCR方法进行rcAAV2检测,qPCR反应体系为2×T5 Fast qPCR Mix(Probe) 10 μL、引物混合液0.1 μL、探针1 μL、50×ROX Reference Dye I 0.4 μL、EASY Dilution 3.5 μL、处理后的细胞裂解物5 μL,qPCR扩增程序:95 ℃,10 min;[95 ℃,15 s;60 ℃,1 min]40个循环。对方法进行灵敏度、准确度、精密度和专属性验证。结果:所建立的检测rcAAV2的方法灵敏度可达到每10⁸ vg<1 TCID50 rcAAV;qPCR方法回收率在77.6%~91.2%;每人3次(2人)实验均得到相同结果,方法专属性良好。结论:所建立的2轮感染扩增后qPCR检测的方法可应用于rAAV2-ND4样品中rcAAV2的检测。
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  不同血清型腺相关病毒衣壳蛋白氨基酸残基序列分析^*

  侯宗文, 秦玺, 陶磊, 史新昌, 张怡轩

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2017-2024. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.04

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  目的:分析不同血清型腺相关病毒衣壳蛋白(VP1)氨基酸残基序列,建立相似性比较方法和数据库,预测VP1氨基酸残基序列突变后可能隶属的血清型。方法:对不同血清型腺相关病毒VP1氨基酸残基序列分析,找出共同序列,并对序列进行对齐。分别对疏水氨基酸残基、亲水氨基酸残基和酸/碱氨基酸残基进行单独赋值,赋值参数包括侧链长度、基团数量和解离/结合强度等,再用相关系数法和差值法计算相似度。规定全局电荷决定界值,判断电荷的变化是否会引起蛋白质周围电场的显著变化。最后综合考虑四者的关系,给出与已知血清型VP1氨基酸残基序相似度。通过其他已知血清型的VP1氨基酸残基序进行验证。结果:基本上可以区分不同的血清型,并且对相同血清型中的不同亚型具有一定的容忍度。结论:对腺相关病毒衣壳蛋白VP1氨基酸残基序列与其血清型间的联系进行了探讨,希望对重组腺相关病毒为载体的基因治疗研发提供支持。
活性分析·代谢分析
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  报告基因法检测IL-1Ra生物学活性的研究

  俞露, 刘玉林, 郑依涵, 彭炳淮, 刘景会

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2025-2029. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.05

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  目的:建立报告基因法(reporter gene assay,RGA)检测重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)生物学活性。方法:通过IL-β刺激D10G4.1-NFκB-Luc细胞产生荧光,IL-1Ra抑制此反应,且抑制的效果与其用量具有线性关系测定其生物学活性。对细胞密度、刺激性物质IL-1β的量、拮抗物质IL-1Ra的量、稀释梯度及孵育时间等进行摸索后建立方法,对方法的准确度、线性范围、专属性和耐用性进行考察;用建立的方法与通用法:A375.S2细胞活性法进行比对。结果:成功建立了RGA检测IL-1Ra生物学活性,该方法在效价水平范围50%~160%检测结果的相对偏差均在±12%范围内,回归方程的斜率为1.001 3,相关系数为0.999 8,对不同细胞代次、细胞密度及培养时间考察耐用性的几何变异(GCV)为4.0%。方法耗时较短,检测结果与A375.S2细胞活性法一致,且精密度及准确性都具有显著提高。结论:成功建立了报告基因法检测IL-1Ra生物学活性,并通过了方法验证,可替代A375.S2细胞活性法用于产品的质量控制。
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  引火汤改善OVX+CUMS小鼠抑郁行为的代谢组学研究^*

  徐红丹, 胡晶, 丁亚明, 张悦, 张宁

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2030-2037. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.06

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  目的:运用血清代谢组学的方法探索引火汤(Yinhuo Tang)对卵巢摘除(OVX)联合慢性不可预见性轻度应激(CUMS)小鼠抑郁样行为改善作用的机制。方法:45只昆明小鼠随机分为假手术组(sham组)、去卵巢模型组(OVX+CUMS组)和引火汤组,采用OVX+CUMS复制绝经后抑郁症(PMD)模型。旷场试验和强迫游泳试验观察小鼠的抑郁样行为;HE染色观察各组小鼠海马神经元状态;利用代谢组学方法观察各组小鼠体内血清差异代谢产物的变化,并分析其内在的生物学意义。结果:行为学结果显示,引火汤给药后OVX+CUMS小鼠的抑郁样行为明显改善;HE染色结果显示,引火汤给药后海马神经元形态呈正常现象。代谢组学研究结果显示,引火汤给药后小鼠血液的代谢轮廓均有显著的回调趋势,共鉴定差异代谢产物11个,包括柠檬酸、蒎酸、鞘磷脂、鞘氨醇1-磷酸、前列腺素J2、α-二吗啉酸、(S)-3-羟基丁酸、磷脂酰肌醇、对甲酚葡糖苷酸、对甲酚硫酸盐和酪氨酸有明显回调作用。结论:引火汤能够改善OVX+CUMS诱导抑郁小鼠的抑郁样行为,其作用机制可能是通过调节亚油酸代谢、柠檬酸循环、鞘脂代谢、谷氨酸代谢、乙醛酸和类固醇激素生物合成代谢通路实现的。
成分分析
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  药物分析中基于多糖的手性反相液相色谱筛选策略的评价^*

  陈泳君, 戴丽娜, 毕艺成

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2038-2043. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.07

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  目的:手性控制在立体异构药物的开发中起着至关重要的作用。由于手性分离的复杂性和缺乏可预测性,柱筛选仍然是启动活性药物成分和合成中间体手性方法开发的金标准。手性反相液相色谱(RPLC)因它在各种基质中的通用性而获得了研究者的青睐,基于此方法进一步探索基于层的手性RPLC筛选策略,用于筛选和分析原料药或中间体。方法:构建和分析手性药物数据库原料药或中间体的手性筛选数据库,共3 401个条目,建立了基于层的手性RPLC筛选策略。结果:用梯度洗脱法筛选了17种多糖基手性固定相和4种流动相。选择10个含有2个流动相的手性固定相,成功地分离了82%的筛网。提出了2个手性RPLC筛选层,第1层(AZ、OD、ID和IG)和第2层(AY、OJ、OZ、IA、IC和IH)以及2个流动相,以使第1层的命中率达到70%,组合集的命中率达到80%。结论:建立了相对简洁高效的多糖手性RPLC筛选策略,且该系统可实自动报告和适用性良好。
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  基于一测多评结合响应面法的蒲地蓝消炎片多指标成分含量测定^*

  王琼芬, 张梦奇, 石婧, 徐虹, 刘婷, 李彬

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2044-2052. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.08

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  目的:建立HPLC一测多评法测定蒲地蓝消炎片中多指标成分含量,并验证方法的准确性。方法:应用Box-Behnken响应面法优化样品前处理方法,以料液比、甲醇浓度、提取时间为影响因素,各成分含量综合评分为评价指标,确定最佳提取条件。以黄芩苷为内参物,建立单咖啡酰酒石酸、菊苣酸、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素的相对校正因子,并计算含量,同时采用外标法测定各成分含量,比较计算值和实测值的差异,以验证一测多评法的准确性和可行性。采用Agilent Poroshell 120 SB-C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,2.7 μm),流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,柱温30 ℃,检测波长326、274 nm,进样量2 μL。结果:优化后的提取条件为料液比1∶125(0.4 g→50 mL),甲醇浓度60%,提取时间1.5 h。6个成分在各自范围内线性关系良好(r≥0.999 6),平均加样回收率为98.1%~101.8%,RSD为0.34%~1.1%,单咖啡酰酒石酸、菊苣酸、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素相对校正因子依次为1.008、0.919、1.369、0.857、0.642,且在不同试验条件下重现性良好(RSD<3%),一测多评法计算结果与外标法实测值之间无显著差异。结论:一测多评结合响应面法建立的蒲地蓝消炎片多指标成分含量测定方法准确可靠、简便可行,可用于该制剂质量控制。
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  款冬花及蜜款冬花HPLC特征图谱和一测多评分析方法建立和应用^*

  李铮, 季加威, 杜小伟, 于密密, 秦雯, 傅欣彤

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2053-2061. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.09

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  目的:建立款冬花及蜜款冬花的HPLC特征图谱,采用一测多评方法测定10个指标性成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、款冬酮及甲基丁酰-3,14-Z-去氢款冬素酯)的含量,并验证方法的准确性,为其质量控制提供参考依据。方法:采用C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,建立款冬花及蜜款冬花HPLC 特征图谱;采用二极管阵列检测器按不同时间段变换波长(0~15 min,330 nm;15~20 min,254 nm;20~30 min,330 nm;30~45 min,220 nm),以芦丁为参照物,建立一测多评同时测定上述10个成分的方法。结果:建立款冬花与蜜款冬花的特征图谱,确定了14个特征峰,62 批样品色谱图的相似度均大于0.90。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异槲皮苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、款冬酮、甲基丁酰-3,14-Z-去氢款冬素酯相对于芦丁的校正因子分别为0.694、0.690、0.876、0.744、0.585、0.529、0.571、0.896、1.778;且在不同实验条件下重现性良好(RSD<5.0%);一测多评法的计算结果与外标法实测值之间无显著差异。结论:建立的特征图谱可以提高款冬花与蜜款冬花的质量控制水平;一测多评同时测定10个成分的方法快速准确、简便高效,专属性良好。
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  聚乙烯醇栓塞微球对吉西他滨载药特性研究^*

  李奋强, 苏东君, 李更相, 党磊, 彭玉星, 陈忠科, 王文辉

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2062-2065. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.10

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  目的:探讨聚乙烯醇栓塞微球(蓝色型,Callispheres^R)加载及释放吉西他滨特性。方法:高效液相分析法考察Callispheres^R加载吉西他滨的载药性能,探讨载药量,载药特性,释放特性。结果:Callispheres^R在40min内可吸附40%以上的吉西他滨,吸附了吉西他滨的Callispheres^R在64 h内可释放191.5 mg(92.34%)的吉西他滨。结论:Callispheres^R可以加载吉西他滨并在较长时间内缓慢释放。
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  右美沙芬愈创甘油醚糖浆中蔗糖及单糖含量分析

  王亚君, 唐立超, 许永彬, 郑淑凤

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2066-2071. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.11

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  目的:建立一种高效液相色谱-示差折光检测器(HPLC-RID)方法检测右美沙芬愈创甘油醚糖浆中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量,从含糖量的角度评价该制剂质量。方法:采用氨基键合硅胶为填充剂的Phenomenex NH Luna色谱柱(250 mm × 4.6 mm,3 μm),示差折光检测器,以水-乙腈(25∶75)为流动相,柱温为 40 ℃,流速为1.0 mL·min^-1,进样体积为20 μL。结果:在该色谱条件下,果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖能得到良好分离。3个目标成分,果糖在1.515~30.3 mg·mL^-1,葡萄糖在3.52~70.4 mg·mL^-1,蔗糖在4.462~89.240 mg·mL^-1与峰面积呈线性关系。加样回收率,果糖为99.6%,葡萄糖为99.3%,蔗糖为101.1%,RSD均小于2.0%。3家企业的共73批次糖浆剂中均未检出麦芽糖,未发现违规投料;14批样品中蔗糖含量低于2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0116规定的45%(g·mL^-1),不合格率为19.2%。较低pH导致蔗糖降解可能是不合格的原因。结论:该方法稳定、简便,可用于右美沙芬愈创甘油醚糖浆中蔗糖以及其转化糖的含量测定,也可用于麦芽糖违规投料筛查。建议右美沙芬愈创甘油醚糖浆pH控制在4~5,降低蔗糖降解率,稳定药品质量。
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  基于多组分含量测定及多元统计分析研究茜草、大茜草及大叶茜草^*

  李欣, 高天鹏, 张明童, 郭晓霞, 李冬华, 马潇

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2072-2080. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.12

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  目的:建立多组分含量测定并结合多元统计分析,研究茜草与大茜草、大叶茜草,以期找出三者的成分差异,为茜草的鉴别提供研究基础。方法:以ACE Excel 5 C₁₈(250 mm×4.6 mm,5 μm)为色谱柱,以甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^-1,检测波长为250 nm,进样量为10 μL,柱温为30 ℃。对24批茜草饮片、10批大茜草和8批大叶茜草进行茜素、芦西定、异茜草素、羟基茜草素、6-羟基甲基异茜草素、大黄酚、大叶茜草素7个成分的含量测定,并将测得结果通过聚类和偏最小二乘法(PLS-DA)进行分析评价。结果:建立了茜草、大茜草与大叶茜草的多组分含量测定方法,测得7个成分的质量分数分别为:0.000 4%~0.037 6%、未检出~0.049 2%、0.001 0%~0.016 9%、0.003 4%~0.052 5%、0.002 8%~0.086 9%、0.002 3%~0.018 6%、0.059 5%~0.298 8%;通过聚类分析与偏最小二乘法(PLS-DA)均可将茜草聚为1类,大茜草聚为1类,大叶茜草聚为1类。结论:通过多组分含量测定,应用聚类分析、偏最小二乘法(PLS-DA)可区分茜草与大茜草、大叶茜草。此方法的建立为茜草的质量控制及评价提供了分析方法和数据支撑。
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  基于UPLC-MS/MS测定鹿茸饮片中13个激素的含量^*

  陆雨顺, 王泽帅, 沙纪越, 霍晓慧, 曲迪, 孙印石

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2081-2089. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.13

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  目的:利用UPLC-MS/MS法测定10批鹿茸中4个雄激素(诺龙、雄烯二酮、睾酮、甲睾酮),3个孕激素(炔诺酮、孕酮、甲羟孕酮),4个雌激素(己烯雌酚、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇)和2个皮质醇激素(可的松、氢化可的松)的含量,明确鹿茸整支和不同部位饮片(蜡片、粉片、纱片、骨片)中13个激素的含量。方法:样品经甲醇提取,N-丙基乙二胺(PSA)和中性氧化铝净化,经ACQUITY BEH C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)分离,分别在电喷雾正负离子模式下以多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)进行测定。结果:鹿茸中雄烯二酮、睾酮、孕酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、可的松、氢化可的松9个激素均有检出,诺龙、炔诺酮、甲睾酮及甲羟孕酮未检出。其中雄烯二酮含量最少,平均含量为0.29 μg·kg^-1,低于睾酮的平均含量1.95 μg·kg^-1。4个雌激素检出量较高,占13个激素的50.7%,其中己烯雌酚含量最高,平均含量为3.23 μg·kg^-1。此外,鹿茸蜡片中13个激素含量显著高于粉片、纱片和骨片,平均含量为34.62 μg·kg^-1。粉片、纱片和骨片中13个激素的平均含量分别为19.68、14.60、12.72 μg·kg^-1,无显著差异。结论:该检测方法前处理过程简单,灵敏度、准确度及精密度均符合要求,适用于鹿茸中激素的检测。
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  UPLC-MS/MS法同时测定排石合剂中10个特征成分含量^*

  李均艳, 李舒琪, 刘辉, 王芝燕, 何一琴, 刘永利

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2090-2097. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.14

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  目的:建立UPLC-MS/MS法同时测定排石合剂中京尼平苷酸、羟基红花黄色素A、绿原酸、苦杏仁苷、王不留行黄酮苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、杯苋甾酮、丹皮酚、甘草酸铵10个特征成分的含量。方法:供试品经70%甲醇超声处理,Waters HSS T3 C₁₈(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1;电喷雾正负离子源同时监测,多反应监测(MRM)模式。结果:方法重复性、准确度良好,10个成分的平均回收率在99.0%~101.0%,RSD为0.090%~4.3%,在各自浓度范围内线性关系良好,含量结果分别为31.129~34.256、95.456~98.741、126.85~129.43、238.62~240.90、45.620~47.520、26.124~28.412、13.852~15.030、16.632~17.854、800.41~805.56、78.485~80.963 μg·mL^-1。结论:本研究建立的方法快速简便,选择性好,准确可靠,为排石合剂的质量控制提供科学依据。
安全监测
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  风寒咳嗽丸添加水稻源性成分检测方法的研究

  郭琳, 王菲菲, 戴忠, 马双成

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2098-2104. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.15

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  目的:采用化学分析及基因检测等技术建立风寒咳嗽丸中水稻源性成分的检测方法,制定相应的新标准,以规范药品生产企业的非法行为,保障用药安全。方法:采用高效液相色谱法对不同来源的风寒咳嗽丸中的成分进行比对,并对其淀粉含量进行测定;采用PCR方法对不同来源的样品进行基因筛查,并优化样品前处理方法和DNA提取过程,对方法的检出限、精密度和重复性进行考察。结果:不同来源的样品指纹图谱明显不同,淀粉含量差异很大。PCR方法证明了问题样品掺入了水稻源性成分,该方法检测限为1 g·kg^-1,精密度及重复性良好;实验结果表明2批次问题样品和1批次问题混合粉均掺入了水稻源性成分。结论:建立了风寒咳嗽丸中掺伪水稻源性成分的PCR检验检测标准,弥补了此类掺伪手段在监管中的漏洞。
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  过氧化氢氧化与阀切换离子色谱法检测食盐中的亚硝酸盐

  唐嘉怡, 郑杨杨, 黄雪婷, Nesterenko Pavel N, 叶明立, 陈梅兰

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2105-2112. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.16

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  目的:利用过氧化氢氧化与阀切换离子色谱法测定食盐中亚硝酸盐含量。方法:利用氧化剂(过氧化氢)将食盐样品溶液中的NO₂^-氧化为NO₃^-,再通过阀切换,洗脱大部分Cl^-和Br^-,收集氧化生成的NO₃^-于定量环中,定量环中的NO₃^-经氢氧化钾淋洗液进入AS11-HC保护柱(50 mm×4 mm)和分析柱(250 mm×4 mm)进行分离,再进行电导检测,通过检测NO₃^-的含量间接得到NO₂^-的含量。结果:在0.01~1.00 mg·L^-1的线性范围内,r=0.999 9,RSD(n=7)为2.3%,检测限为8.57×10^-4 mg·L^-1,回收率为85.2%~111.0%。22个样品中5个样品未检出NO₂^-,其他样品介于6.94~88.70 μg·g^-1。结论:该实验方法准确、灵敏,可应用于食盐中亚硝酸盐的检测。
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  质量提取法测试盐酸法舒地尔注射液玻璃安瓿包装容器的密封完整性^*

  聂蕾, 刘玉美, 赵延轲, 王国民, 文慧英, 王俊苏

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2113-2120. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.17

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  目的:通过测试盐酸法舒地尔注射液玻璃安瓿包装容器的密封完整性,研究质量提取法在玻璃安瓶包装密封完整性考察上的运用。方法:采用质量提取法测试,进行方法参数开发及检测限、准确度、重复性等方法学验证。采用经过验证的方法,对盐酸法舒地尔注射液玻璃安瓿包装的进行加速和长期0、3月稳定性的密封完整性检测。结果:建立了盐酸法舒地尔注射液玻璃安瓿包装的密封完整性质量提取法测试方法,关键时间参数总泄漏抽真空时间(预抽真空1)、大漏抽真空时间(预抽真空2)、微漏抽真空时间(抽真空2)、微漏稳定时间(稳定2)分别优化确立为4、3、20、8 s;检测限为2 μm;准确度为100%区分阴性阳性样品,重复性好。结论:质量提取法可以应用于小容量玻璃安瓿包装的密封完整性测试,该方法灵敏度高,稳定性好,结果真实可靠,能有效测试注射剂玻璃安瓿包装容器密封完整性。
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  超高效液相色谱-串联质谱法测定一次性使用输液器中双酚A的含量

  丁豪

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2121-2126. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.18

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  目的:建立检测一次性使用输液器中双酚A含量的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS)。方法:采用ZORBAX Eclipse Plus C₁₈(50 mm×3.0 mm,1.8 μm)色谱柱进行分离,选择甲醇、0.3%氨水为流动相进行梯度洗脱,多反应监测(MRM)模式检测,基质外标法定量。结果:双酚A的检测限和定量限分别为3.1、10.2 ng·mL^-1,在10~200 ng·mL^-1范围内线性关系良好(r=0.999 7),在pH 3.5缓冲溶液、pH 8.0缓冲溶液、15%乙醇溶液和0.9%氯化钠注射液中的加标回收率在90.8%~102.3%,应用于4批一次性使用输液器的检测,有1批被检出。结论:方法操作简单,结果准确稳定,灵敏度高,线性范围较宽,满足样品测定的要求,可用于一次性使用输液器中双酚A的检测分析。
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  市售外用抗鼻炎类凝胶产品中激素类添加物的检测及调查分析^*

  郭建博, 王建山, 林芳, 南冠君, 王松, 张小飞, 李涛, 刘海静

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2127-2136. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.19

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  目的:建立了市售抗鼻炎凝胶类产品中激素非法添加检测方法,对采集的来源于网络销售的22批次产品进行检测,并对暴露风险进行评估,提出监管建议。方法:试样中40个激素类非法添加物采用乙腈提取,高效液相色谱分离,串联质谱检测,基质外标法定量,考察测定方法学,对市售样品进行检测。结果:方法学考察试验表明,40个激素类非法添加物线性关系良好,方法精密度、重复性、回收率符合方法学要求。对市售的22批样品进行检测,总体检出阳性率为45.5%(10/22),其中械字号产品检测7批次,非法添加物检出阳性2批次,涉及非法添加倍氯米松双丙酸酯(1批次)和氯倍他索丙酸酯(1批次);消字号产品检测15批次,检出阳性8批次,涉及非法添加氯倍他索丙酸酯(7批次)和布地奈德(1批次)。结论:监测结果显示,网络销售的械字号和消字号鼻炎治疗及相关产品存在系统性的激素非法添加问题,可能产生系统性的特定人群暴露风险,亟需对网络销售的械字号和消字号鼻炎治疗及相关产品加强监管、整顿。在监测过程中检出3种激素类药物,建议加强对激素类原料药的监管。
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  降纤酶关键质量属性研究^*

  邹剑, 李炯, 杨金亮, 李炎, 杨蕾, 马晶, 袁月

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2137-2146. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.20

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  目的:通过对降纤酶鉴别、纯度、分子量、等电点、N端序列、比活性6个方面关键质量属性的表征,为后续标准提高提供依据。方法:采用SDS-PAGE电泳法分析不同来源的蛇毒原料;采用紫外-可见分光光度法、SDS-PAGE电泳法、体积排阻色谱和反相超高效液相色谱法、基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法、等电聚焦电泳法、“edman”N端测序法以及凝固法和生色底物法对不同企业提供的降纤酶进行测定和分析。结果:不同来源的尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组成基本一致,尖吻蝮蛇蛇毒和白眉蝮蛇蛇毒蛋白质组成差异较大。降纤酶对苯甲酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐最大吸收波长为247 nm,对苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐最大吸收波长为254 nm,但对苯甲酰-DL-精氨酰对硝基苯胺无水解作用。降纤酶能完全水解纤维蛋白原α肽链,活性受到苯甲基磺酰氟、二硫苏糖醇和对氨基苯甲醚的抑制。尺寸排阻高效液相色谱法降纤酶纯度测定结果高于反向超高效液相色谱法,前者为99.9%,后者为95.4%。SDS-PAGE电泳法测降纤酶完整分子量受标准品线性范围的影响,采用10~250 kDa范围的标准品点拟合,降纤酶完整分子量为(42.1±1.6)kDa;采用10~100 kDa范围的标准品点拟合,降纤酶分子量为(38.4±1.3)kDa。MALDI-TOF-MS法测得降纤酶完整分子量为(33.3±0.5)kDa,脱糖基分子量为(28.8±0.02)kDa。降纤酶pI值在3.0~4.0之间,N端序列为VIGGVECDINEHRFL。凝固法和生色底物法测比活性相关性显著(P<0.01),但凝固法结果高于生色底物法。结论:不同企业提供的降纤酶的6个方面的关键质量属性基本一致。现行降纤酶药品国家标准中鉴别、纯度、分子量等项目有待进一步增修订。
质量分析
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  基于不确定曲线策略的近红外定量分析丹参酮提取物中丹参酮ⅡA含量^*

  薛忠, 刘德玄, 曹春琪, 徐冰, 王亚博, 律涛

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2147-2153. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.21

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  目的:基于不确定度曲线建立丹参酮提取物中丹参酮ⅡA含量的近红外(NIR)定量分析方法。方法:采集丹参酮提取物近红外光谱,采用HPLC作为参考方法分析丹参酮提取物中丹参酮ⅡA的含量,建立丹参酮提取物中ⅡA含量和近红外光谱之间的偏最小二乘(PLS)定量模型。通过K-S(Kennard-Stone)方法划分校正集和校正测试集,比较不同的光谱预处理方法建立最优PLS定量回归模型。采用“6×3×3”验证实验得到验证数据,得出NIR分析方法的验证信息,并计算NIR定量分析方法的不确定度,构建不确定度曲线并评价所建立方法的有效性。结果:选择1std数据预处理方法来建立PLS定量回归模型,所建立的NIR定量分析方法真实性,精密度良好,丹参酮ⅡA含量的有效定量范围为2.04%~27.64%,分析结果准确有效。结论:不确定曲线策略可以同时提供NIR分析方法的验证信息和不确定度信息,能够降低分析方法的使用风险,保障NIR分析结果的准确性和可靠性。
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  清热解毒口服液指纹图谱的建立及质量评价模式研究^*

  陈荣, 钟水生, 王亚琼, 张超, 陈卫

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2154-2164. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.22

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  目的: 基于清热解毒口服液HPLC指纹图谱,建立质量评价方式,考察各厂家样品质量情况。方法:采用Diomonsil Plus C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),以甲醇-0.4%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速为1 mL·min^-1,柱温为35 ℃,检测波长为238、280(29 min,238→280 nm),建立指纹图谱,结合化学计量学及统计学技术,进行初步质量评价。结果:清热解毒口服液指纹图谱共标定30个共有峰,全部进行归属,其中确证成分26个(根据对照品比对确证22个,根据QTOF/MS和文献确证4个),结合化学计量学中聚类分析和主成分分析,可将不同厂家样品予以区分,质量较好的厂家样品栀子苷、龙胆苦苷以及金银花的酚酸类成分含量明显更高,而质量差的厂家样品只有黄芩苷含量与其他厂家无明显差异。结论:该方法能宏观评价各厂家样品的优劣,将指纹图谱和化学计量学以及统计学技术联用是较为适宜、全面的质量评价手段。
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  重组新型冠状病毒XBB.1.5变异株疫苗(5型腺病毒载体)毒种质量评价

  吴小红, 杨立宏, 郑秀玉, 赵丹华, 黄艳秋, 付瑞, 刘欣玉, 李玉华, 叶强

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2165-2170. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2023.12.23

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  目的:对重组新型冠状病毒XBB.1.5变异株疫苗(5型腺病毒载体)毒种进行质量评价。方法:利用PCR和琼脂糖凝胶电泳对毒种进行腺病毒载体鉴别和目的基因鉴别,以鉴别其载体是否为腺病毒载体、插入序列是否正确;对毒种进行病毒感染滴度(IFU)检测,以评估其病毒感染力;对毒种进行无菌检查、支原体检查、外源病毒因子检查、腺相关病毒(AAV)检测,以检测是否有外源性污染。结果:腺病毒载体和插入片段均正确,毒种具有很高的感染力,且无细菌、真菌、支原体、外源病毒因子、腺相关病毒(AAV)污染。结论:重组新型冠状病毒XBB.1.5变异株疫苗(5型腺病毒载体)毒种质量符合已上市同类产品质量标准,鉴别、活性和安全性指标检验方法对于疫苗生产具有指导意义。
文题索引
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  《药物分析杂志》第43卷第1~12期文题索引

  药物分析杂志. 2023, 43(12): 2171-2194.

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