目的：比较评价靶基因16S rRNA、tufA、femA、rpoB和gap序列对葡萄球菌种水平的鉴定能力。方法：选择60株菌种鉴定明确的葡萄球菌（涵盖18个种），比较评价16S rRNA基因序列及VITEK 2全自动微生物生化鉴定系统对常见葡萄球菌鉴定的准确性；采用PCR方法特异扩增60株菌tufA、femA、rpoB和gap的基因序列，并对阳性扩增产物进行核酸测序，利用Mega 7.0和DNASP 5.0软件分析靶基因序列多样性，通过序列聚类关系分析，进一步评价不同靶基因序列对葡萄球菌种水平的分子鉴定能力。结果：16S rRNA基因序列比对不能有效区分山羊葡萄球菌和头状葡萄球菌，而VITEK方法则将巴氏葡萄球菌错误鉴定为沃氏葡萄球菌。序列多样性分析表明，尽管靶基因tufA、femA、rpoB和gap序列比16S rRNA基因序列多样性更强，但基于tufA、femA、rpoB和gap序列的聚类分析在种水平仍会错误鉴定部分葡萄球菌，如表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、腐生葡萄球菌和科氏葡萄球菌等。进一步评价16S rRNA基因序列分别与靶基因tufA、femA、rpoB和gap的串联序列对葡萄球菌种水平的鉴定能力，结果表明只有靶基因femA与16S rRNA基因的串联组合能够实现对18种葡萄球菌的准确鉴定，而其他靶基因与16S rRNA基因的串联组合对于葡萄球菌种水平的鉴定能力没有明显改善。结论：基于单个靶基因的序列分析会造成部分葡萄球菌种水平的错误鉴定，而基于16S rRNA与femA基因的串联序列分析则能够显著提高对葡萄球菌种水平鉴定的准确性。