目的：应用高效液相色谱（HPLC）技术，建立同时测定复合维生素B片中微量叶酸、维生素B₁₂和生物素含量的方法。方法：采用Alltima C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以50 mmol·L^-1磷酸二氢铵溶液（磷酸调至pH 3.0）-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，检测波长200 nm，柱温30℃。结果：在本方法中，3个成分的线性关系良好，线性相关系数（r）为1.000；精密度良好，RSD小于1.9%；回收率良好，叶酸、维生素B₁₂和生物素的3个加样浓度的平均回收率（n=9）分别为100.6%、99.7%和99.7%；稳定性良好，3种成分在24 h内保持稳定，RSD小于1.0%。3批复合维生素B片中叶酸、维生素B₁₂和生物素的含量测定结果分别为480.9~493.2、47.31~48.38、50.80~52.63 μg·片^-1。结论：该方可作为复合维生素B片中微量叶酸、维生素B₁₂和生物素同时测定的方法。