目的：对二黄汤方药半仿生法（SBE法）≤1 000 Da提取液的指纹图谱各特征峰的来源进行归属研究。方法：采用SBE法分别制备二黄汤全方和各单味药黄芩、黄连、甘草的提取液，绘制相应的HPLC指纹图谱，通过比对，确定其特征峰的来源；通过对照品比对，鉴定部分特征峰的成分。色谱条件：采用Diamonsil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，0.02 mol·L^-1乙酸铵溶液（冰乙酸调pH 4.0）（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，流速0.5 mL·min^-1，检测波长265 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。结果：二黄汤的SBE法≤1 000 Da提取液的HPLC指纹图谱有32个特征峰，其中峰9、11、13、16、17、25、26、27、30、31来自黄芩，峰15、20、21来自黄连，峰3、10、12、23、24、32来自甘草，峰2、18、19来自黄芩、黄连和甘草，峰14、28、29来自黄芩和甘草，峰1、4、5、6、7、8、22来自黄连和甘草。以保留时间和紫外吸收曲线为判断依据，进行对照品比对，鉴别出甘草苷、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、甘草素、甘草酸、黄芩素、甘草次酸共8个已知成分，其中峰22是含小檗碱和甘草素的混合峰，与归属结果相同。结论：二黄汤SBE法提取液指纹图谱的建立符合要求，归属研究方法合理。与对照品比对，二黄汤SBE法≤1 000 Da提取液中各特征峰的归属结果准确，可为特征峰的成分鉴定和谱效关系研究提供依据。