目的:优化《中华人民共和国药典》2015年版草乌含量测定项下方法,并测定草乌中新乌头碱、次乌头碱及乌头碱的含量。方法:采用Xcharge C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速1 mL·min-1,柱温30℃,检测波长235 nm。结果:新乌头碱、次乌头碱及乌头碱的检测下限分别为2.68、3.49和7.14μg·g-1,线性范围分别为20.9～1 045μg·mL-1（r=0.999 9）、15.12～756μg·mL-1（r=0.999 9）、9.43～471.5μg·mL-1（r=0.999 9）,回收率分别为98.3%、97.7%和97.6%;3批样品中新乌头碱、次乌头碱及乌头碱的含量范围分别为3.51～4.85、1.23～1.44、0.40～0.74 mg·g-1。结论:本研究建立的高效液相色谱方法稳定可靠,分析时间短,可用于草乌药材中双酯型生物碱的含量测定。