2022年, 第42卷, 第1期　
刊出日期：2022-01-31

  

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重组激素类药物质量分析专栏
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  重组激素类药物国家标准研究思考^*

  梁成罡, 李晶, 张慧, 吕萍, 李湛军

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 3-12. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.01

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  重组激素类药物是最早用于临床的治疗性生物技术制品,是全球销售额仅次于单抗的第二大类重组蛋白药物。此类药物通常有来自组织提取的已上市天然药物“副本”,结构和功能相关性研究成熟且疗效明确,在重大慢性病、退行性疾病等治疗领域具有不可替代的作用。本文就重组激素类药物药典标准研究过程所总体遵循和关注的技术要点、遇到的问题和解决措施、所开展针对性研究的依据和结果评价思路进行讨论,并对今后拟开展的同类品种国家标准研究策略进行展望和探讨。
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  人胰岛素及其类似物UPLC-MS/MS全序列分析研究^*

  胡馨月, 丁晓丽, 陈莹, 张慧, 李晶, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 13-22. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.02

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  目的: 建立采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人胰岛素及其类似物全序列的方法。方法:该方法以人胰岛素为主要研究对象,首先对其进行还原烷基化前处理,后进行UPLC-MS/MS分析。采用ACQUITY UPLC peptide BEH C₁₈(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 300Å)色谱柱,流动相A为0.1%甲酸/水溶液,流动相B为0.1%甲酸/乙腈溶液,梯度洗脱(0～10 min,3%B→60%B;10～10.5 min,60%B→95%B;10.5～14 min,95%B;14～14.5 min,95%B→3%B;14.5～20 min,3%B),流速0.3 mL·min^-1,柱温50 ℃;采用电喷雾离子源正离子(ESI⁺)扫描,通过优化质谱参数,对人胰岛素及其类似物进行“top-town”全序列的测定分析,并对人胰岛素的序列测定方法进行了深入的研究,同时考察该方法对门冬胰岛素和赖脯胰岛素的适用性。结果:该方法能够较好地覆盖人胰岛素A和B链的全序列,通过b/y离子分析,5个高强度b/y离子的离子强度RSD在20%之内,A链与B链一级质量数准确,其精密度、准确度良好;该方法可区分与其他胰岛素类似物的序列的不同,专属性良好,且对门冬胰岛素和赖脯胰岛素具有良好的适用性。结论:该方法操作简便,准确性好,专属性强,为胰岛素及其类似物的全序列测定提供了数据支持。
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  甘精胰岛素注射液有关物质分析方法研究^*

  丁晓丽, 陈莹, 胡馨月, 李晶, 张慧, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 23-32. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.03

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  目的: 优化甘精胰岛素注射液有关物质分析方法,论证现行标准规定限度科学性,并对主要有关物质进行鉴别。方法:采用Thermo scientific Bio-Basic-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以氯化钠-磷酸盐缓冲液-乙腈(18.4 g∶250 mL∶250 mL,加水至1 000 mL)为流动相A,氯化钠-磷酸盐缓冲液-乙腈(3.2 g∶250 mL∶650 mL,加水至1 000 mL)为流动相B,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,检测波长214 nm,柱温35 ℃。利用该方法收集含量最大有关物质组分并利用LC-MS方法进行鉴别。分析色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈ Column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,300Å),以0.1%甲酸水溶液为流动相A,0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱,柱温为50 ℃。质谱数据采集条件为MS^E模式,一级质谱能量40 V。结果:该RP-HPLC有关物质分析方法,方法学验证结果良好,能够有效分离并准确测定样品中的有关物质;经鉴定,甘精胰岛素注射液的主要有关物质为B链第3位天冬酰胺的脱-NH₃降解产物,即3^B-琥珀酰亚胺-甘精胰岛素。结论:优化后的RP-HPLC方法能够有效用于甘精胰岛素注射液有关物质分析,现行国家标准有关物质限度规定科学合理,能够满足甘精胰岛素注射液货架期内的质控需求。
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  重组人促卵泡激素氧化亚基分析方法研究^*

  杨慧敏, 张伟, 孙悦, 吕萍, 王绿音, 李懿, 张慧, 李晶, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 33-40. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.04

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  目的:研究建立重组人促卵泡激素(rhFSH)氧化亚基分析方法,制备稳定的氧化亚基分析用系统适用性溶液。方法:通过加入过氧化氢氧化破坏重组人促卵泡激素,后加入甲硫氨酸终止该氧化作用,制备系统适用性溶液。采用RP-HPLC法分离分析重组人促卵泡激素氧化亚基。使用C₄色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为0.2 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.5),流动相B为80%乙腈;流速1 mL·min^-1;柱温30 ℃;检测波长210 nm;梯度洗脱(0~10 min,82%A→74%A;10~25 min,74%A→60%A;25~26 min,60%A→20%A;26~56 min,20%A;56~56.1 min,20%A→82%A;56.1~75 min,82%A)。结果:加入甲硫氨酸可有效终止氧化作用,制备得到稳定的系统适用性溶液。优化建立的氧化亚基分析方法专属性良好,重复性(RSD=0.22%)、色谱柱耐用性(RSD=3.21%)、36 h内溶液稳定性(RSD=0.65%)结果良好。9批样品中氧化亚基含量范围为0.687%~1.001%。结论:优化建立的氧化亚基分析方法可对重组人促卵泡激素中的氧化亚基进行准确定量,能够用作重组人促卵泡激素的质量研究和放行检验;研究制备的系统适用性溶液可准确地对氧化亚基进行峰定位。
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  重组人生长激素原液及注射液中有关物质UPLC分析方法建立^*

  陆俊杰, 李晶, 陈莹, 李懿, 张伟, 张慧, 吕萍,秦希月, 高向东, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 41-50. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.05

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  目的: 建立超高效液相色谱法测定重组人生长激素原液及注射液中的有关物质。方法:采用Waters BEH C₁₈ 300Å色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),以12.5 mmol·L^-1磷酸氢二钾缓冲溶液-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,检测波长220 nm,柱温45 ℃。结果:在选定的色谱条件下,能分离出较多有关物质,且主峰与各有关物质峰均能良好分离;质量浓度在0.25~5 mg·mL^-1的范围内线性关系良好。精密度、耐用性及稳定性(72 h内)良好。根据质谱定性结果,探索了制备脱酰胺杂质、氧化杂质、脱水杂质等主要有关物质的处理方法。对于重组人生长激素注射液,本方法与现有标准相比,能够弥补我国注册标准方法中检测有关物质数量少,彼此间分离度不高的缺点,同时也克服了欧洲药典需要2种机理不同的独立实验方能完成有关物质控制的问题。结论:本方法适用于测定重组人生长激素原液及注射液中的有关物质。
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  时间分辨荧光免疫分析法测定人胰岛素生物学活性^*

  杨艳枫, 王绿音, 梁誉龄, 李湛军, 张慧, 李晶, 高向东, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 51-59. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.06

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  目的:利用时间分辨荧光免疫分析系统建立人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法。方法:以CHO-INSRB1284转基因细胞2.5×10⁵个·mL^-1作为靶细胞,以400 pmol·mL^-1作为初始浓度对人胰岛素进行3倍系列稀释,随后药物与靶细胞作用20 min,通过时间分辨荧光免疫分析系统,进行生物学活性检测,对该方法进行关键参数的优化,并依据2020年版《中华人民共和国药典》四部通则9401和ICH指导原则Q2(R1)、Q6B进行验证。结果:人胰岛素在本方法中存在良好的量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。本方法专属性强,5个效价水平(64%、80%、100%、125%及156%)的相对生物学活性(n=8)的几何平均值分别为(55.8±2.06)%、(82.1±5.52)%、(94.4±5.46)%、(121.4±5.94)%、(154.4±8.37)%,相对偏倚及其90%置信区间分别为 -12.8%(-16.3%, -9.9%)、2.6%(-4.4%, 9.5%)、-5.6%(-11.2%, -0.3%)、-2.9%(-7.7%, -1.8%)、-1.0%(-7.1%,3.9%),相对偏倚及置信区间的绝对值均不超过20%,表明该方法相对准确度良好。5个效价水平的几何变异系数(GCV)及其置信区间的上限均小于20%,结果证明此方法精密性较好。线性范围为64%～156%,斜率为1.031,R²大于0.98。结论:本研究利用时间分辨荧光免疫分析系统成功建立了人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法,该方法可用于人胰岛素体外药效评价和质量控制。
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  基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究^*

  孙爽, 王绿音, 李晶, 吕萍, 徐可铮, 梁誉龄, 张慧, 李湛军, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 60-67. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.07

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  目的: 利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16~20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R²大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10⁵ 个·mL^-1,rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^-1,1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.00)%、(94±2.24)%、(99±2.68)%、(94±3.03)%,RSD均小于4%。结论:本研究利用转基因细胞成功建立rhFSH-Fc生物学活性测定方法,该方法操作简便,重复性好,准确性高,可用于rhFSH-Fc产品的常规检测。
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  第1批重组人绒促性素(生物测定用)国家标准品的制备与协作标定^*

  李湛军, 梁誉龄, 李懿, 胡馨月, 胡宇驰, 曹春然, 魏霞,祝清芬, 张娟, 冯润东, 王莉芳, 何丽秀, 李晶, 张慧, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 68-77. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.08

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  目的: 制备并标定第1批重组人绒促性素(recombinant human chorionic gonadotrophin,rHCG)国家标准品(生物测定用)。方法:以WHO第5批绒促性素国际标准品07/364效价为162 IU·瓶^-1作为标准,采用2020年版《中华人民共和国药典》四部1209绒促性素生物测定法,联合5个实验室对第1批rHCG待标品进行生物活性协作标定。对待标品原液进行了等电点、肽图、相对分子质量测定等结构确认。对待标品进行了紫外分光光度法蛋白含量测定、SEC-HPLC法纯度和聚体分析、RP-HPLC法氧化亚基分析等关键理化性质分析,并进行了稳定性考察。结果:,rHCG素待标品经协作标定,最终定值其生物效价为6 400 IU·瓶^-1;,rHCG素含量约为290 μg·瓶^-1,SEC-HPLC纯度约为100%。结构确认结果符合要求;聚体、解离亚基、氧化亚基等各项理化指标符合规定;稳定性考察结果满足要求。结论:本批待标品可作为第1批rHCG国家标准品,以供rHCG及相关制剂的生物效价测定用,定值为6 400 IU·瓶^-1。
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  首批贝那鲁肽国家标准品的研制^*

  丁晓丽, 吕萍, 蔡永清, 段徐华, 王绿音, 陈莹, 徐可铮, 李晶,张伟, 胡馨月, 李懿, 孙悦, 张慧, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 78-85. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.09

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  目的:建立首批贝那鲁肽国家标准品。方法:采用质谱法、N-末端氨基酸序列测定、氨基酸比值法以及质量肽图法进行结构确证;采用HPLC法测定纯度;采用质量平衡法对原料药A(大规格样品)进行含量赋值,然后以原料药A为对照品,采用HPLC外标法对原料药B(待标品)的含量进行标定;采用体外细胞培养法对原料药B(待标品)进行效价测定。并对原料药B(待标品)稳定性及均一性进行了考察。结果:确证了贝那鲁肽的结构,并确定了首批贝那鲁肽国家标准品的含量为0.932 mg·支^-1,生物效价为1.0×10⁴ U·支^-1。原料药B(待标品)分别在4 ℃及25 ℃,RH 80%条件下放置10 d,纯度无明显下降,光照10 d纯度明显下降。15支原料药B(待标品)含量测定结果的RSD为0.86%,均一性良好。结论:首批贝那鲁肽国家标准品可作为贝那鲁肽及相关制剂HPLC法鉴别、含量测定及生物活性测定用标准品。
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  新型定点修饰的聚乙二醇化重组人生长激素修饰位点研究^*

  李晶, 邵正康, 胡馨月, 李懿, 梁成罡

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 86-93. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.10

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  目的:建立新型定点修饰的聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)修饰位点的研究方法,为该类新型修饰技术产物的质量评价提供依据。方法:采用MALDI-TOF质谱分析修饰产物中聚乙二醇(PEG)的修饰个数及修饰肽段的质量数;采用LC-Q-TOF质谱分析修饰位点,分析色谱柱为UPLC色谱柱(Protein ACQUITY BEH C₄ Column,150 mm×2.1 mm,1.7 μm,300Å),以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液为流动相,进行梯度洗脱,柱温为40 ℃。质谱数据采集条件为MS^E模式,一级质谱能量4 eV,二级碎裂电压30~55 eV。结果:修饰蛋白中PEG的平均相对分子质量为30 000,并且每个PEG-rhGH分子中仅存在1个PEG修饰;原型蛋白重组人生长激素中第134位精氨酸被替换为赖氨酸,且该赖氨酸的ε-氨基与连接子HOOC-O-CH₂-CH₂-N₃中的羧基端共价结合,连接子另一端的叠氮基团与活化后的PEG偶联后生成修饰产物。结论:联合运用多种质谱技术,通过比对人生长激素国家对照品、原型蛋白与修饰蛋白的酶切肽图谱及对特定肽段的一级、二级碎片的分子量分析,可以确定新型定点修饰的PEG-rhGH的修饰位点。
综述专论
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  代谢组学在阿尔茨海默症病理机制和中药疗效评价研究中的应用进展^*

  王辉, 戴建英, 何晓莉, 刘敏, 洪战英

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 94-107. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.11

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  阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是1种复杂的神经退行性疾病,研究表明其代谢改变与早期疾病机制有关。为扩大生物系统中代谢物检测的范围,基于多种分析平台联用的代谢组学策略,开发精确有效、侵入性小的生物标志物是AD代谢组学的研究热点,而空间代谢组学为生物组织代谢和药物代谢提供了全新视角。越来越多的中药单体、单味药材及中药复方被证明对AD具有一定的药效作用,从代谢组学角度探讨药效机制,可以提供潜在的生物标志物和代谢模式,有助于定量评价药物疗效及探索作用机制。本文综述了近5年代谢组学在AD病理机制和中药疗效评价研究中的应用进展。
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  鱼腥草化学成分、药理及质量控制研究进展^*

  武营雪, 丁倩云, 刘静, 戴忠, 马双成

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 108-120. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.12

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  鱼腥草在我国具有悠久的食用历史和药用传统,具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效。现代研究表明,其所含主要成分为挥发油、黄酮和生物碱,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和抗菌等活性。本文通过查阅国内外文献,对其化学成分、提取工艺、药理活性、临床使用、安全性和质量控制等方面的研究进展进行了概述,以期为鱼腥草的应用及开发提供参考或借鉴。
成分分析
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  基于衍生化-HPLC测定酶解葡萄糖的方法评价六神曲中糖化酶活力^*

  王郡瑶, 程显隆, 李明华, 李婷, 魏锋, 马双成

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 121-126. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.13

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  目的:建立柱前衍生化的高效液相色谱法测定不同厂家六神曲中葡萄糖含量,通过葡萄糖含量计算糖化酶活力,评价市售六神曲质量。方法:样品以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生化试剂,进行柱前衍生化。采用C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈为流动相A,0.05 mol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH 6.8)为流动相B,梯度洗脱,柱温30 ℃,检测波长为250 nm。结果:葡萄糖进样量线性方程相关系数为0.999 4;平均回收率(n=6)为100.6%,RSD小于3.0%。不同生产厂家的六神曲糖化酶活力为4.51~290.27 U·μmol^-1,差异较大。结论:该方法可用于六神曲中酶解葡萄糖含量的测定,评价糖化酶活力及为后续六神曲质量控制及等级评价提供数据支持和理论依据。
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  基于双波长融合HPLC图谱的银屑病外用方中7种活性成分定量分析^*

  洪亮, 陈海明, 卢传坚, 李绍平, 赵静

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 127-132. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.14

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  目的: 测定银屑病外用方中7个主要活性成分(新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷、柠檬苦素)含量。方法:采用Waters Xbrige BEH C₁₈色谱柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm),以水(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(0~5 min,17%B;5~10 min,17%B→20%B;10~15 min,20%B;15~25 min,20%B→100%B),流速1.0 mL·min^-1,柱温30 ℃,进样量5 μL,检测波长为292 nm(0~19 min,新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷)、210 nm(19~25 min,柠檬苦素),使用MATLAB软件编程,对CSV格式数据进行双波长融合。结果:新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷和柠檬苦素线性范围分别为39.06～1 250 μg·mL^-1(r=0.999 9)、26.25~840 μg·mL^-1(r=0.999 7)、18.64～596.4 μg·mL^-1(r=0.999 8)、6.31～202 μg·mL^-1(r=0.999 6)、2.53～80.8 μg·mL^-1(r=0.999 8)、1.33～42.6 μg·mL^-1(r=0.999 7)和5.08～162.4 μg·mL^-1(r=0.999 6),平均加样回收率(n=6)为96.1%~102.2%,RSD为0.48%~1.7%。银屑病外用方自制及医院提供的样品中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷和柠檬苦素的含量分别为1.06、1.21、0.87、0.30、0.09、0.07、0.22 mg·mL^-1和0.35、0.32、0.17、0.08、0.04、0.03、0.21 mg·mL^-1。结论:该方法能够快速、准确地测定银屑病外用方中7个活性成分含量,可用于银屑病外用方的质量控制。
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  UFLC-MS/MS法同时测定黄芪建中汤中6个活性成分的含量^*

  关皎, 王悦, 廖宇, 高兴, 周新新, 冯波, 崔悦, 朱鹤云

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 133-139. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.15

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  目的:建立一种同时测定黄芪建中汤中6个活性成分(毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、桂皮酸、芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷和甘草酸)含量的超快速液相色谱-串联质谱法。方法:采用Shim-Pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(0～6.0 min,12%B→25%B;6.0～7.0 min,25%B→45%B;7.0～11.0 min,45%B→60%B;11.0～13.0 min,60%B→70%B),平衡时间5 min,流速0.4 mL·min^-1,柱温30 ℃,进样量5 μL;采用电喷雾电离源(ESI源),负离子模式检测,多反应监测(MRM)。结果:毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、桂皮酸、芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷和甘草酸质量浓度分别在0.2~10 μg·mL^-1(r=0.999 6)、0.5~25 μg·mL^-1(r=0.999 5)、2~100 μg·mL^-1(r=0.999 6)、0.5~25 μg·mL^-1(r=0.999 8)、0.5~25 μg·mL^-1(r=0.999 7)和0.5~25 μg·mL^-1(r=0.999 6)范围内与峰面积呈良好线性关系;平均回收率(n=9)分别为98.3%、98.4%、98.9%、98.0%、98.8%和99.2%。6批样品中上述6个成分的含量分别为0.114~0.128、0.118~0.144、4.19~4.52、1.03~1.12、0.277~0.345、0.679~0.798 mg·mL^-1。结论:本方法灵敏度高,稳定性好,可用于黄芪建中汤的质量控制。
安全监测
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  基于体外消化/Caco-2细胞模型测定白花蛇舌草中镉的生物有效性及风险评估^*

  左甜甜, 罗飞亚, 金红宇, 孙磊, 余坤子, 邢书霞, 马双成

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 140-146. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.16

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  目的:通过考察白花蛇舌草中镉(Cd)的生物有效性,以科学地评价Cd对人体的健康风险,并为限量标准的制定提供依据。方法:采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS法)测定白花蛇舌草中Cd的残留量,并建立体外生理提取试验(PBET)体外模拟消化/Caco-2细胞模型考察白花蛇舌草中Cd的生物有效性。此外,采用危害指数法(HI法)对白花蛇舌草中Cd的残留总量以及生物有效量的风险进行评估。结果:3批白花蛇舌草中Cd的残留总量范围为10.970~81.492 mg·kg^-1。经Caco-2细胞转运后,白花蛇舌草中Cd的生物有效性分别为3.06%、1.60%、6.62%。风险评估的结果表明:Caco-2细胞转运前,所有批次白花蛇舌草Cd的HI值均大于1,健康风险不可接受;Caco-2细胞转运后,3批白花蛇舌草中Cd的HI值均≤1,风险降低至安全范围内。结论:白花蛇舌草中的Cd可能不能被人体完全吸收。本研究为更加科学、客观地评估中药中重金属对人体的健康风险,制定更加科学、合理的重金属限量标准提供了重要的技术支撑。
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  二氧化碳信号检测的快速微生物方法应用于细胞制品无菌检查的评估^*

  厉高慜, 潘伟婧, 王灿, 陈钢, 邵泓

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 147-155. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.17

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  目的:评价基于二氧化碳检测原理的BacT/ALERT 3D Dual-T快速微生物检测系统作为药典无菌检查法的替代用于创新生物制品的可行性。方法:以细胞制品作为应用对象,参考各国药典及国外指导原则,研究快速方法在专属性、检测限、非劣效性方面是否可替代药典方法。结果:评价结果表明快速方法在专属性和检测限参数上达到了药典方法性能相当,大部分情况下可比药典方法更快地报告阳性结果,快速方法对产品质量的决策不劣于药典方法,且在数据完整性方面具备优势。结论:在风险管理的前提下,经验证的快速方法可作为药典无菌检查的替代方法用于创新生物制品的快速放行。
标准研讨
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  门冬酰胺酶效价和纯度测定方法研究^*

  王悦, 陈欣桐, 李京, 范慧红

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 156-165. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.18

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  目的: 建立和优化鉴别、纯度和效价测定等质量控制方法,提高和完善大肠埃希菌(Escherichia coli)、欧文氏菌(Erwinia carotovora)来源的门冬酰胺酶的质量标准。方法:考察了Xbridge protein BEH SEC(300 mm×7.8 mm,3.5 μm,200Å)和TSK G3000swxl(300 mm×7.8 mm,5 μm)2款色谱柱在纯度测定方法中的分离情况,并对流动相进行了优化;考察了效价测定方法中反应的量效关系和线性范围,探讨了斜率比模型和标准曲线法的效价计算方式。结果:以0.1 mol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH 6.7)为流动相,采用Xbridge protein BEH SEC色谱柱进行分离,主峰前后各杂质峰分离度有了较大改善。2种菌种来源的门冬酰胺酶效价反应剂量在2~30 U·mL^-1范围内均呈直线反应,r均大于0.995,标准曲线测定方法更为简单、准确,样品采用高低双剂量可以有效消除实验误差,双剂量测定偏差可小于±2.0%。结论:与绝对法相比,相对法在效价测定的准确度和重现性方面都有较大提高;优化后的纯度测定方法提高了杂质峰的分离度,可以更好地避免因积分方式带来的结果误差。
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  基于酶解法采用超高效液相色谱-串联质谱法检测阿胶、黄明胶、鹿角胶中猪皮特征肽

  谢强胜, 高天阳, 孙铜, 刁飞燕, 胡文岳, 翟光喜, 李启艳

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 166-171. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.19

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  目的: 建立基于酶解法采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS法)检测阿胶、黄明胶和鹿角胶中猪皮特征肽。方法:采用胰蛋白酶进行酶解处理;使用Xbridge BEH-C₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm),柱温30 ℃,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0～1 min,95%A;1～5 min,95%A→70%A;5～5.1 min,70%A→10%A;5.1～7 min,10%A;7～7.1 min,10%A→95%A;7.1～10 min,95%A),流速0.4 mL·min^-1,进样量为2 μL;电喷雾离子源(ESI⁺),采用多重反应监测模式(MRM),正离子模式,对猪皮特征肽目标离子m/z 406.5(双电荷)→657.3和m/z 406.5(双电荷)→556.3进行检测。结果:阿胶、黄明胶、鹿角胶中分别掺入猪皮特征肽,质量浓度范围为5～500 ng·mL^-1时,测得浓度与色谱峰面积成正比,线性方程分别为Y=3.020 4X+8.998(r²=0.999 7),Y=3.178 6X+11.906 9(r²=0.999 7),Y=3.046 5X+6.879(r²=0.998 6)。检测限为11 mg·kg^-1,阿胶样品中猪皮杂质残留限值为76.7 mg·kg^-1。28批阿胶样品中,有2批样品中检出猪皮特征肽。6批黄明胶、6批鹿角胶中均未检出猪皮特征肽。结论:所建立方法灵敏度高,重复性好,操作简便快捷,专属性强,可用于阿胶、黄明胶和鹿角胶中掺假猪皮的检测。
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  毛细管电泳结合激光诱导荧光检测分析单抗N糖谱的方法学联合验证^*

  王文波, 武刚, 于传飞, 张峰, 王兰

  药物分析杂志. 2022, 42(1): 172-178. https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.01.20

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  目的: 对毛细管电泳结合激光诱导荧光(CE-LIF)检测单抗N糖谱方法进行多家实验室的联合验证。方法:依据国际人用药品注册技术协调会(ICH)Q2_R1指导原则和2015年版《中华人民共和国药典》通则9101,开展方法学验证。评价指标包括专属性、线性、准确度、精密度、定量限、范围和耐用性。结果:验证数据表明,该方法具有良好的特异性、准确性、精密性和耐用性。蛋白量在100~400 μg范围内具有良好的线性,R²大于0.97,且回收率在81%~109%范围内。精密性评价结果显示,G0F、Man5、G1F(1,6)、G1F(1,3)和G2F的校正峰面积百分比和迁移时间的RSD值均小于10%。该方法的定量下限为0.016%,可对在0.016%~77.233%范围内的单个色谱峰进行准确定量分析。同时多个条件下的耐用性评价结果表明该方法具有耐用性,峰面积百分比的RSD小于9%,迁移时间的RSD小于0.1%。结论:组织开展了基于CE-LIF的检测单抗N糖谱的方法学联合验证,结果表明方法可行,可用于单抗N糖谱的检测。