目的：建立高效液相色谱串联质谱法测定大鼠血浆中红霉素、螺旋霉素Ⅰ、脱水红霉素、红霉素A烯醇醚、新螺旋霉素Ⅰ的浓度。方法：用乙腈提取，SCX固相萃取柱净化，上清液氮气吹干后甲醇复溶待测；5个大环内酯类成分通过Hypersil Gold C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）分离，质谱电喷雾正离子模式检测，多反应离子监测扫描，标准曲线法定量。结果：5个大环内酯类成分浓度在5~500 ng·mL^-1范围内的线性关系良好（r>0.999），在3个浓度水平下，5个大环内酯类成分的回收率可达84.6%~96.2%，精密度为1.6%~2.5%；5个大环内酯类成分的基质效应在81.23%~109.3%之间；方法检测下限为1.4~1.9 μg·kg^-1，方法定量下限为4.5~6.8 μg·kg^-1。结论：HPLC-MS法测定大鼠血浆中5个大环内酯类成分的分析方法简单、快速，特异性强，适用于血浆中大环内酯类成分的测定。