类固醇激素是一类由肾上腺和性腺分泌的微量高效能化学物质。类固醇激素的变化在新生儿筛查、内分泌疾病及相关代谢性疾病的诊断中具有重要参考价值。因此，寻找一种可靠、便捷的分析方法成为临床疾病诊断和治疗的首要任务。在各类检测方法中，液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）联用技术因具有高灵敏度、高专属性和高通量的特点，在临床类固醇激素代谢分析领域显示极大的潜力。本文综述了该技术在临床内源性类固醇激素分析方面的应用及进展，特别是样品前处理、色谱及质谱条件方面，并简要阐述LC-MS/MS在肾上腺皮质激素及性激素测定方面的特点及优势，从而为临床应用提供更快速准确的诊断依据。