目的：比较分析一种3位硫酸化的肝素四糖及其同分异构体的结构与性质。方法：以抗凝血药物肝素为原料，采用肝素酶Ⅱ对肝素进行完全酶解，完全酶解后，酶解产物通过凝胶渗透色谱将不同聚合度的寡糖片段分开，并采用强阴离子交换高效液相色谱以pH为3.5的2 mol·L^-1氯化钠溶液和去离子水为流动相，采用线性洗脱，流速4 mL·min^-1，检测波长232 nm，根据不同肝素寡糖的电荷强度和电荷密度对寡糖进行进一步分离纯化，获得一种对肝素酶具有抵抗作用的特殊肝素四糖和它的同分异构体。采用电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱结合核磁共振波谱来确定肝素四糖的结构序列。并采用竞争型表面等离子体共振（SPR）的方法研究肝素四糖与抗凝血酶Ⅲ（AT Ⅲ）的结合作用。结果：肝素四糖的结构序列为ΔUA-GlcNAc6S-GlcUA-GlcNS3S和ΔUA-GlcNAc6S-GlcUA-GlcNS6S。通过特征肝素四糖的比较分析表明高分辨质谱在分析肝素来源结构相似修饰位点多变的寡糖结构上具有优势，并获得了肝素同分异构体不同硫酸化修饰位点核磁共振波谱的变化规律，总结了3位硫酸化肝素四糖典型的核磁特征。这对肝素四糖结构相似，但是ΔUA-GlcNAc6S-GlcUA-GlcNS3S的离子强度要略高于ΔUA-GlcNAc6S-GlcUA-GlcNS6S。然而二者均没有结合ATⅢ的能力，不具有抗凝血活性。结论：通过高分辨质谱和核磁共振波谱可以将肝素酶解产物中3位硫酸化的肝素四糖与其他四糖区别开来，肝素四糖不具有抗凝血活性。