目的：为全面分析翠云草双黄酮类化学成分，制订翠云草整体质量评价提供依据。方法：采用提取分离结合波谱学分析技术，分离鉴定单体双黄酮类化合物；采用LC-UV-MS技术，研究翠云草中已知化合物的质谱裂解规律，推测其他成分。结果：从翠云草中分离得到4个单体双黄酮类化合物，分别为罗波斯塔双黄酮-4'-甲醚（1）、2，3，2″，3″-四氢穗花杉双黄酮（2）、2，3-二氢穗花杉双黄酮（3）、2，3-二氢穗花杉双黄酮-4'-甲醚（4）；归属了翠云草中14个特征成分峰，其中穗花杉双黄酮母核8个、罗波斯塔双黄酮母核5个、4'-O-6″-双苯醚母核1个。结论：本研究为翠云草指纹图谱分析、双黄酮类成分含量测定提供了依据，且为制订翠云草质量标准提供了对照物质。