目的： 解析抗EpCAM+CD3双特异性抗体（BsAb）的关键表征。方法： 以抗EpCAM+CD3双特异性抗体为研究对象，超高效液相色谱串联质谱联用技术（LC-MS/MS）检测相对分子质量、肽图（氨基酸序列）、N-糖基化位点、糖型及各糖型含量、二硫键位点；表面等离子体共振（SPR）技术测定其与上皮细胞粘附因子（EpCAM）、白细胞分化簇3（CD3）和Fc受体（FcRs）的亲和力。结果： 含糖基化的完整抗体、轻链、重链和单链的相对分子质量分别为128 521.78、24 117.83、50 808.85和53 585.87；不含糖完整抗体、轻链、重链和单链的相对分子质量分别为125 633.30、24 117.85、49 364.53和52 141.30；对象BsAb氨基酸序列与理论序列一致；N-糖基化位点位于重链Asn₃₀₀和单链Asn₃₂₆；N-连接寡糖的糖型包括以岩藻糖化的双天线复杂N-糖（G0F占全部糖型含量77.10%）为主的11种糖型；对象BsAb内含13对二硫键；单链第Cys₁₀₅位和第Cys₂₄₉为游离巯基；SPR测定结果显示：对象BsAb与EpCAM、CD3的亲和力分别为2.71×10^-8和5.94×10^-7 mol·L^-1，与FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅡb、FcγRⅢa、FcγRⅢb和FcRn的亲和力分别为2.89×10^-8、8.85×10^-7、7.94×10^-6、3.69×10^-7、2.73×10^-6和8.77×10^-7 mol·L^-1。结论： 采用LC-MS/MS和SPR技术可有效解析抗EpCAM+CD3 BsAb的关键表征，为其质量控制和产品放行提供依据。