目的：采用全自动二维液相色谱（2D-LC-UV）建立快速测定伏立康唑血药浓度的方法，并应用于临床。方法：样品去除蛋白后直接进样，待测物在一维柱Aston SC2（4.6 mm×25 mm，5μm）上初步分离，通过中间柱Aston SH（3.0 mm×10 mm，5μm）截取保留，转移到二维色谱柱Aston SCB（4.6 mm×100 mm，5μm）上进一步分离。一维流动相为VCV-1D移动相，流速0.7 mL·min^-1；二维流动相为OPI-1有机移动相-BPI-1碱性移动相-MPI-1移动相（30：48：22），流速1.0 mL·min^-1；柱温40℃；紫外检测波长262 nm。结果：伏立康唑与各杂质分离良好，在0.38~12μg·mL^-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9999），可在10 min内完整出峰，方法回收率高于95%；日内、日间的精密度RSD均小于5%；稳定性试验RSD小于5%。所建立方法对79名肾移植住院患者进行了伏立康血药浓度检测共280例次，常规剂量未达到治疗浓度的占55%，超过安全浓度的占10.4%，在治疗浓度内的占34.6%。结论：本方法简便快速，结果准确，稳定性良好，自动化程度高，不依赖于专门的技术人员，适用于临床伏立康唑快速检测。