目的：通过特异性引物的聚合酶链式反应（PCR）法结合微芯片电泳检测的方法，特异性鉴别宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3种水蛭品种。方法：针对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种的线粒体同源序列，设计区分正伪品水蛭以及分别鉴定3个品种水蛭样品的特异性引物；通过PCR和微芯片电泳检测的方法验证所设计引物的特异性；将验证得到的特异性引物进行整合，建立3个品种的特异性引物用于三重PCR的方法。结果：确定了用于区分宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种中正伪品的特异性引物KA；确定了宽体金线蛭特异性引物KT，日本医蛭特异性引物RI，菲牛蛭特异性引物FN；建立了3种特异性引物进行三重PCR鉴别3个品种水蛭药材的方法。结论：通过特异性引物结合三重PCR的方法，可以同步鉴定宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭的人为预混样品，鉴定结果准确，且用于三重PCR的特异性引物不存在引物之间相互结合或非特异性扩增的现象。