目的：探索并建立一种均相时间分辨荧光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）检测方法，用于快速、灵敏、稳定检测单克隆抗体的活性。方法：将检测试剂、待检样品加入96半孔板，室温振荡孵育3 h后在酶标仪上读取荧光信号值，用软件对信号值进行四参数曲线拟和，根据四参数方程计算单抗的相对活性；同时对该方法进行验证。结果：本文构建的检测方法呈典型的反S型剂量效应曲线，且反应缓冲液中添加0.4 mol·L^-1氟化钾可提高荧光响应值。对该方法进行验证，专属性强，只与抗PD-1/PD-L1单抗发生反应；2名不同分析人员重复检测6次，相对效价范围为85%~117%，总RSD为13%；准确性良好，不同浓度供试品溶液回收率均在80%~120%范围内；理论相对活性与实际测得相对活性线性良好，相关系数在0.99以上，斜率接近1.0，符合方法验证要求。结论：通过对HTRF检测条件的摸索及验证，建立了一种新型测定单抗活性的方法，且该方法快速简便，可用于单抗的前期筛选或后期活性检测。