目的：采用在线中心切割超高效二维液相色谱（2D-UPLC）法，建立同时测定复方南星止痛膏中3个双酯型乌头生物碱（新乌头碱、乌头碱和次乌头碱）的含量测定方法。方法：一维UPLC采用Waters XBridgeBEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm 1.7μm），以甲醇-0.008%二乙胺为流动相，梯度洗脱，流速0.1 mL·min^-1，柱温18℃；二维UPLC采用Waters XBridge BEH C₁₈色谱柱（3.0 mm×100 mm 1.7μm），以乙腈-0.01%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速0.7 mL·min^-1，柱温40℃。进样量1μL，检测波长235 nm。结果：新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的线性范围分别为0.66~9.90、0.55~8.20和0.91~13.72μg·mL^-1，R²分别为0.999 5、0.999 9和0.999 6，线性关系良好；3个成分的平均加样回收率在82.5%~88.8%之间，方法的准确度和稳定性均较好；复方南星止痛膏中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量分别在3.2~5.0、0.9~1.3、8.5~10.4 μg·g^-1范围内。结论：该方法有效改善了复方南星止痛膏中待测组分的分离度，极大提高了检测灵敏度，对制剂中的3个双酯型乌头生物碱进行准确定量分析，提高产品的质量控制水平，并为临床用药提供理论支持。