目的：建立一种快速检测孕马尿中雌酮硫酸钠的胶体金免疫层析试纸方法。方法：采用化学合成法将雌酮制备为ESS-17-肟（半抗原），应用混合酸酐法将ESS-17-肟与牛血清白蛋白（BSA）偶联制备为ESS-17-肟-BSA（免疫原），对所得偶联物溶液进行紫外扫描鉴定并计算偶联率。ESS-17-肟-BSA免疫BALB/C小鼠，取血清高滴度小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞，用ELISA法进行阳性筛选。获得阳性克隆细胞株后于BALB/C小鼠体内诱生腹水制备单克隆抗体，抗体纯化后用胶体金标记，通过正交设计确定最佳实验参数，研制出雌酮硫酸钠胶体金免疫层析试纸条。结果：获得经化学结构修饰后的目标抗原ESS-17-肟-BSA，融合克隆后得到4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株2D1、7G4、5F3、2A7，其中2D1抗体纯化后特异强，效价达1.0×10⁶。该抗体制备的胶体金层析试纸条的检测限为1 μg·L^-1，与结构类似物均无交叉反应，此法检测样品结果与高效液相色谱法测定结果比对阳性符合率为85.45%（45/52），阴性符合率为89.58%（43/48），总符合率为88.00%（88/100），结果一致性较好。结论：本研究制备了雌酮硫酸钠免疫原，融合制得抗雌酮硫酸钠特异性单克隆抗体，并研制出以雌酮硫酸钠单克隆抗体为基础的胶体金免疫层析试纸条，能够快速、灵敏地检测孕马尿中的雌酮硫酸钠。