目的：建立高效液相色谱/飞行时间质谱法对鱼肝油中不同维生素A酯的顺反异构体进行分离鉴定。方法：选择YMC C₃₀色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲基叔丁基醚-甲醇-水为流动相梯度洗脱，对鱼肝油中各种维生素A酯进行分离，结合电喷雾正离子化/飞行时间质谱法进行结构推断。并通过对照品比对等方法，对分离得到的顺反异构体做构型鉴定。结果：在本试验研究的2种样品中，鳕鱼肝油胶囊中主要含有全反式与13-顺式维生素A棕榈酸酯，鲨鱼肝油中主要含有全反式与13-顺式维生素A油酸酯、棕榈酸酯与硬脂酸酯，以及全反式花生烯酸酯与十七烷酸酯。结论：本方法能有效地分离鉴定鱼肝油中的多种全反式与13-顺式维生素A酯，可为鱼肝油质量控制提供参考依据。