目的：建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法，用于抗人肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）单抗的专属性鉴别。方法：TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原，释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化，还原剂中和过量的烷化剂。超滤置换酶切缓冲液后进行胰酶酶切并终止。色谱条件：采用Waters UPLC BEH 300 C₁₈（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色谱柱，以0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）为流动相，梯度洗脱（5~120 min，2% B→45% B），流速为0.2 mL·min^-1，检测波长为214 nm；质谱条件：采用电喷雾离子源及正离子模式，数据采集范围m/z为100~1 990。结果：TNF-α单抗重链及轻链的6个互补决定区（CDR）对应肽段由质谱鉴定出，HC CDR2及HC CDR3在色谱峰图中共流出；利妥昔单抗用于评估本方法的专属性，结果显示本方法专属性强，且不受基质的干扰；选定m/z 1 344（M⁺⁵）的色谱峰为参考峰，根据CDR的相对保留时间考察该方法的变异程度，5次重复测定CDR相对保留时间的RSD在0.57%~1.19%之间；中间精密度考察测定的相对保留时间的RSD在0.00%~1.08%之间；胰酶酶切比例在20：1~30：1，酶切时间在17~23 h范围内变化时，相对保留时间的均较小，符合方法耐用性的要求；样品消化后在8℃储存24 h以及-20℃储存5 d的稳定性良好。结论：基于CDR相关肽段鉴别的液质联用肽图分析方法可定性鉴定出TNF-α单抗，方法学验证结果显示该方法适用于抗人TNF-α单抗的专属性鉴别，可用于其质量控制及批检验放行。