目的：对依替米星及其杂质进行分离纯化，并对各杂质进行结构确定。方法：采用高效液相色谱-蒸发光散射法，选用Ultimate LP C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.2 mol·L^-1三氟乙酸溶液-甲醇（84∶16）为流动相，流速0.5 mL·min^-1，漂移管温度65℃，进行HPLC-ELSD分析；采用Ultimate LP-C₁₈色谱柱（250 mm×21.2 mm，5 μm），以0.2 mol·L^-1三氟乙酸水溶液-甲醇（90∶10）为流动相，流速6 mL·min^-1，ELSD为检测器，进行HPLC制备分离；以甲醇-水（80∶20）为流动相，流速0.8 mL·min^-1，进行MS分析；以D₂O为溶剂，采用一维和二维核磁共振谱，对制备得到的杂质进行结构测定。结果：制备分离出4种微量杂质（≤0.03%），MS及NMR分析确定了它们的结构分别为1-N-乙基加洛糖胺、1-N-乙基-3'，4'-二脱氧新霉胺、1-N-乙基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a，1-N-乙基小诺霉素。结论：通过HPLC-ELSD及其HPLC制备分离方法的联用，能迅速检测并分离纯化出微量杂质；综合运用各种一维和二维核磁共振技术对依替米星（ETM）及其杂质的结构进行对比分析，建立了一种快速、准确分析氨基糖苷类抗生素结构的方法。