目的：建立用于检测头孢匹胺钠有关物质的高效液相色谱梯度洗脱法，并对其中关键的有关物质I进行结构鉴定。方法：采用ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.03 mol·L^-1磷酸二氢钾（2 mol·L^-1 NaOH调至pH7.5），流动相B为乙腈；柱温为35℃；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL·min^-1；液质联用方法采用XDB-C₁₈柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）色谱柱，以0.01 mol·L^-1甲酸铵缓冲溶液（pH6.5未调）-乙腈（90∶10）为流动相，检测波长为254 nm，流速为0.4 mL·min^-1，柱温为30℃。采用电喷雾ESI离子源，检测模式为ESI（+），干燥气流速为10 L·min^-1；干燥气温度为340℃，喷雾器为275.8 kPa。结果：头孢匹胺钠主峰与其相关物质之间分离良好，在1.31~41.98 mg·mL^-1范围内头孢匹胺钠呈良好的线性关系（R²=1.000），方法的定量限为2.6 ng，检测限为0.8 ng。采用LC-MS方法鉴定其中有关物质I的结构为头孢匹胺钠的异构体，并用合成方法确证了结构的正确性，其7位侧链手性原子由R型改变为S型。结论：本方法快速准确，起始原料、中间体与主峰，起始原料和中间体之间分离良好，优于现行标准方法，可用于头孢匹胺钠的有关物质检测，为现行方法的有力补充。